Ser-49 in subtilisin J, an extracellular serine protease from B. stearothermophilus, is highly conserved residue among subtilisins from Bacillus sp. Moreover, Ala-48 - Ser-49 peptide bond was known as a primary autolysis site in subtilisin BPN' recently. Previously constructed Asp-49 mutant protein, corresponding to that a more thermostable subtilisin variants, shows proteolytic activity, but so unstable that it was degraded during cultivation in Tyr-58 - Gln-59 peptide bond. The enzymatic activity of the Asp-49 mutant protein is higher than that of wild-type in early growth phase. To elucidate the role of Ser-49 and increase the heat-stability, first, the Ser-49 was replaced with Thr,Asn and Glu. From results of substitution of Ser-49, we concluded that hydroxyl of Ser-49, as H-bond donor and acceptor, is important in prevention of autolysis. Second, in consideration of substrate specificity of subtilisin, The Tyr-58 or Gln-59 weae replaced with various amino acid using Asp-49 mutant as a template. Among the mutants, Asp-49 -$\Delta$Tyr-58 mutant showed a considerably improved resistance to heat. These results demonstrate the powerful probability of protein-engineering in enhancement of heat stability of various enzymes.
B.stearothermophilus 에서 분비되는 서브틸리신 J의 Ser-49은 여러 서브틸리신 계열의 효소군에서 높은 보존도를 보여주며 단백질 표면에 위치하고있다. 또한 Ala-48 - Ser-49 사이가 서브틸리신 BPN'에서 최우선 자가분해 위치임이 발표되었다. 전에 도입한 Asp-49 변이 단백질은 상당히 불안정하여 배양중에 Tyr-58 - Gln-59 사이가 잘려지는것을 알았다. 그러나 초기배양시간의 활성이 야생형보다 높은데 착안하여 첫째, Ser-49 잔기의 역할 규명을 위해 Asn-49, Thr-49, Glu-49 변이 단백질을 얻어, Ser-49 잔기의 -OH 가수소결합의 제공자 역할로 단백질의 안정성에 기여함을 알아내었고, 둘째, 활성 증대와 열안정성의 증대를 위해서 Asp-49 변이 단백질에 Tyr-58 혹은 Glu-59 을 서브틸리신의 기질 특이성을 고려하여 여러 다른 아미노산으로 치환시켰다. 그중에서 Asp-49 - $\triangle$Tyr-58 변이 단백질이 야생형과 비슷한 활성을 지니면서 상당히 증진된 열안정성을 보여주었다. 이상의 결과들은 여러 효소의 단백질공학, 특히 표면 부위의 단백질 공학에 의한 열안정성의 증진 및 여러 다른 특성의 개선 혹은 변형의 가능성을 제시하고있다.
