Extracellular lipase was produced during the late logarithmic growth phase by solvent resistant strain, Pseudomonas putida 3SK. The enzyme was purified to 21 fold with 5.3\% recovery by ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. Molecular weight of the purified enzyme was determined to be 45 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The lipase had an optimum pH range of 8.0 - 9.0 and was stable within the pH range of 4.0 to 10.0. The optimal temperature was $37\,^\circ\!C$ and it was stable up to $75\,^\circ\!C$. When the effects of organic solvents were tested, isooctane was the most suitable for enzymatic fat hydrolysis in the two phase system. Enzyme activity was inhibited by mercury ions whereas its activity was stimulated by calcium ion and taurocholic acid. Also, batch and continuous hydrolysis of olive oil in organicaqueous two phase system have been investigated using whole cell of Pseudomonas putida 3SK as a source of lipase. In two phase system, the strain was fully viable and grown well, and also produced extracellular lipase simultaneously. The optimum conditions for the hydrolysis of triglyceride in two phase system were determined. Isooctane was selected as the most suitable organic solvent in this system. The volumetric ratio of aqueous phase to isooctane was maximum at the ratio of 5:2(v/v). Degree of hydrolysis depending on olive oil concentration in the solvent was maximal at 13.5\% (w/v) and then decreased with the increase of the substrate concentration. At the optimized condition, more than 95\% of degree of hydrolysis was achieved within 24 h at $30\,^\circ\!C$ when the reaction was carried out in a two phase batch stirred reactor. For a long term operation, a continuous stirred reactor was designed. When the reaction was carried out in the continuous stirred reactor, degree of hydrolysis was reached to 91 \% at the dilution rate of 0.2 h$^{-1}$. Satisfactory performance of the two phase bioreactor was obtained in the long term continuous operation which lasted for at least 30 days by feeding organic solvent containing the olive oil and aqueous media separately. When a beef tallow was applied to this system as a substrate, operation of the two phase reactor was also feasible.
1. 내 유기용매성 균주로 알려진 Pseudomonas putida 3SK 가 성장기에 비례하여 리파제를 세포외로 분비함을 확인 하였으며, 이온 교환 수지와 젤 거름 수지를 통과하여 약 5.28 \% 의 수율(recovery)과 21 배(fold) 로 순수분리 정제 되어졌다. 순수분리된 효소는 SDS-PAGE 를 이용해 효소의 분자량을 결정 했을 때 약 45 kDa 정도로 나타났다. 이 효소 활성의 최적 pH 는 약 8.0과 9.0 사이였으며 최적 온도는 35$^\circ$C 에서 40$^\circ$C 사이였다. 또한 pH 4 에서 10 까지의 광범위한 pH에서 이효소가 안정함을 확인 하였고, 약 75$^\circ$C 까지 이 효소가 열에 안정함을 확인 하였다. 특히 효소의 내 용매성을 조사하기 위해 여러가지 유기용매를 사용한 이상계에서 지방 가수분해 반응을 수행하였을때 이소옥탄이 반응성에 있어서는 가장 좋음을 관찰할수 있었다. 이 효소의 활성은 수은 이온에 강한 저해현상을 나타내는 반면 칼슘이온이나 타코린산에 의하여 증진되어짐을 알 수 있었다. 2. 지방산을 생산할 목적으로 Pseudomonas putida 3SK를 사용하여 물과 유기용매의 이상계에서 유지의 가수분해에 대해 연구하였다. Pseudomonas putida 3SK는 유기용매에 내성이 있는 균주로서 유기용매와 물의 이상계에서도 유기용매가 없는 배지와 같은정도로 세포성장을 유지함과 동시에 세포외로 리파제를 생산하였다. 이 반응계에 가장 적당한 유기용매를 선택하기 위해 여러가지 유기용매를 시험하여 보았을때 이중 이소옥탄이 가장 알맞은 유기용매임을 알 수 있었다. 이 때 사용한 유기용매의 극성에 따라 가수분해 정도와 균주의 생장을 비교할 수 있었는데 Pseudomonas putida 3SK의 경우는 Log P값이 3 이상에서는 자라지 못했으며 Log P 값이 3 이상인 경우 직쇄형 지방족 탄화수소의 경우 가수분해 정도가 Log P와 깊은 관계가 있음을 관찰할 수 있었다. 가수 분해 반응이 가장 잘 일어나게하는 물층과 유기용매층의 부피비는 5:2 였으며 유지의 완전 가수분해가 가능한 올리브유의 최대 첨가량은 13.5 \%(w/v) 였다. 3. 이상계의 회분식 반응기에서 반응을 수행하였을때 24 시간이내에 95 \% 의 유지의 가수분해 수율을 얻을수 있었다. 반응 kinetics를 조사하기 위하여 Gas Chromatography 를 이용하여 동력학적분석을 수행한 결과 이 반응에 적합한 반응 model을 제시할수 있었다. 또한 장기간 반응을 수행하기위하여 이상계에서 연속식 교반 반응기를 고안하였는데 희석율 0.2 $hr^{-1}$ 에서 일정한 균체농도와 효소농도를유지시켰을때 91 \% 이상의 가수분해 수율을 얻을수 있었다. 이 반응을 30일 이상 연속적으로 수행하였을때 90\% 이상의 가수분해수율을 유지시킬수 있었다. 또한 상온에서 고체인 우지를 기질로 사용한 경우도, 올리브유에 비해서는 가수분해 정도가 조금 떨어지지만, 가수분해 반응이 잘 일어남을 관찰할 수 있었다. 4. 유지의 가수분해를 위한 생물 반응기에서 최대의 생산성을 위해서는 역 마이셀계나 역상계보다 이상계가 훨씬 유리함은 이미 입증되어져있지만, 다른 유기용매를 사용한 반응계와 마찬가지로 이상계에서의 효소 반응은 계면에서의 효소의 불활성이 문제가 되고 있다. 이런 측면에서 효소가 아닌 생균을 반응계에 사용하는것은 효소의 연속적인 공급을 통해 반응속도를 증가시키고 유기 용매에 보다 안정한 균주의 탐색을 통해 이상계에서의 반응속도를 높일수 있으므로 지방산 생산분야에 있어 신기술이라 할수 있다. 효소를 사용하는것이 아닌 생균을 사용하여 유기 용매가 첨가된 조건에서 유지의 가수분해를 수행한 예는 현재까지 보고된 바가 없으며 생물학적 유지가수분해 방법의 새로운 시도이다. 더불어 현재까지 정립되어진 유지의 가수분해를 위한 효소동력학을 생균을 사용한 새로운 반응계의 동력학으로 해석해 보는 새로운 시도들도 기술적으로 가능해졌다. 이런 기술 개발로 인해 현재까지 확립된 효소를 이용한 유지의 가수분해 기술에 근원적인 문제를 해결할수 있음과 동시에 기존의 기술에 신기술을 조합 시킴으로써 유지의 가수분해를 위한 최적의 반응기를 개발할 수 있으리라 생각된다.
