The four different enzymes, Hpall endonuclease, Hpall methylase, Mspl endonuclease, and Mspl methylase, were used to understand their specific interactions with the common recognition sequence, CCGG. The synthesized 6 derivatives of the oligonucleotide, AGCCCGGGCT, contains a variety of single base analogue substitutions within the tetrameric recognition core. Cytosine was replaced by 5-methylcytosine or 5-bromocytosine to determine whether these substituted groups affect enzyme-substrate interactions in the major groove. Guanine was replaced by inosine to determine the role of the 2-amino group located in the minor groove. Those substitutions resulted in altered reactivity of the enzymes. Steady state kinetic values were determined for normal and modified oligonucleotides. The addition of 5-bromine or 5-methyl group interfered with the interactions between these enzymes and substrates in the major groove except that Mspl endonuclease could cleave the sequence even with the 5-methyl group at the second cytosine position. The data suggest that there are close contacts between C5 positions of both cytosine residues and these enzymes except that Mspl endonuclease has a space for a methyl group at the C5 position of the second cytosine residue. Hpall or Mspl endonuclease was not able to cleave the oligonucleotides containing inosine nucleotide at either guanine position. The data presented in this thesis also showed that minor groove interactions between 2-amino groups of both guanine residues and both enzymes were essential for the reactions. However, these interactions were not essential for both methylases except that Mspl methylase was not able to methylate the oligonucleotide substituted with inosine nucleotide at the first guanine position.
여러 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하는 염기서열 특이적인 DNA-단백질 상호작용에 관여하는 기능기를 조사하기 위하여 똑같은 염기서열 d(pCCGG) 인식 부위를 가지는 HpaII 제한효소, HpaII 메틸화효소, MspI 제한효소, MspI 메틸화효소를 선택하여 이들 인식부위에 대한 효소들의 작용을 비교함으로써 효소가 염기서열을 인식하는 방법에 대하여 알아보았다. Major groove쪽에 위치하는 C 잔기의 5번 탄소 부위의 역할을 알아보기 위해서 5-bromocytosine이나 5-methylcytosine으로 치환된 oligonucleotide 기질을 사용하였으며, minor groove에 위치하는 G 잔기의 2-amino group의 역할을 알아보기위해서 hypoxanthine으로 치환된 oligonucleotide를 기질로 사용하였다. HpaII 제한효소는 첫번째와 두번째 C 잔기가 5-bromocytosine이나 5-methylcytosine으로 치환된 oligonucleotide는 전혀 절단하지 못하는데서 major groove에 있는 C 잔기의 5번 탄소부위가 HpaII 제한효소 반응에 중요한 역할을 하고있다는 것을 알수 있었으며 첫번째와 두번째 guanine이 inosine으로 치환된 기질도 절단하지 못하는것으로보아 minor groove에 있는 2-amino group은 염기인식에 중요한 접촉점으로 생각된다. HpaII 메틸화효소도 역시 5-bromine group이나 5-methyl group이 양 C 잔기에 부과된 기질은 메틸화시키지 못하였으나 첫번째 와 두번째 G 잔기의 2-amino group이 제거된 기질에서는 느린 속도이지만 기질을 메틸화 시켰다. 이로부터 HpaII 메틸화효소 반응에 양 C 잔기의 5번 탄소부위가 중요함을 알수 있었다. MspI 제한효소는 5-bromocytosine으로 양 C 잔기가 치환된 기질은 절단하지 못한반면 두번째 C 잔기가 5-methylcytosine으로 치환된 oligonucleotide는 보고된 바와 같이 느린 속도로 절단하였으며 첫번째 C 잔기의 5-methyl group이 부가된 oligonucleotide는 절단하지 못하였다. 양 G 잔기가 deoxyinosine으로 치환된 기질도 절단하지 못하는 것으로 보아 MspI 제한효소 반응에 major groove에 위치한 첫번째 C 잔기의 5번 탄소부위와 minor groove에 위치한 양 G 잔기의 2-amino group이 중요한 것으로 보여진다. MspI 메틸화효소의 경우 양 C 잔기에 5-bromine group이나 5-methyl group이 부가된 기질과 첫번째 G 잔기의 2-amino group이 제거된 기질을 메틸화 시키지 못하였으나 두번째 G 잔기의 2-amino group이 제거된 기질을 비록 느린 속도이지만 메틸화 시키는 것으로보아 MspI 메틸화효소의 경우 양 C 잔기의 5번 탄소부위와 첫번째 G 잔기의 2-amino group이 효소반응에 중요한 것으로 생각된다. 이들 결과로부터 MspI 제한효소가 두 번째 C 잔기의 5번 탄소 부위에 메틸기를 수용할수 있는 공간을 가진것을 제외하고는 양 제한효소는 인식부위 내의 helix의 양 groove와 밀접하게 접촉하고 있으리라고 생각되며 양 메틸화 효소는 MspI 메틸화 효소가 첫번째 G잔기의 2-amino과 강하게 작용하고있는 것을 제외하면 major groove와는 밀접한 접촉을 하고있지만 minor groove와는 그렇지 않다는 것을 알 수 있었다. 네 효소가 같은 염기서열을 인식하지만 그 인식방법은 각각 다른 것으로 보아 활성 부위의 구조도 다를 것으로 생각된다.
