An arylamide carcinogen, 2-Acetylaminofluorene (AAF), inhibited mouse spleen cell blastogenesis in response to the T-cell lectin, concanavalin A (Con A), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)/Ionomycin activation, and following stimulation by alloantigens as measured by mixed lymphocyte responses (MLR). AAF also markedly suppressed the T-cell dependent antibody forming cell response to sheep red blood cells (sRBC). However, the general metabolic activities such as protein synthesis and glutathione level in spleen cell cultures were not depressed by AAF-exposure. Meanwhile, AAF was most inhibitory on both the sRBC IgM antibody forming cell response and Con A-stimulated proliferation when added during the first 24 hr following initiation of culture. Direct addition of high concentrations of AAF (100 μM) to spleen cell cultures at 48 hr following Con A stimulation produced a very modest inhibition (＜20%) of T-cell proliferation as compared to 90% when added at the time cultures were initiated. Similarly, AAF (75 and 100 μM) produced a greater than 80% inhibition of the in vitro AFC response when spleen cells were sensitized with antigen in presence of AAF. In contrast, no inhibition of the IgM AFC response was produced when AAF (75 μM) was added to spleen cell cultures 48 or 72 hr after antigen sensitization. Con A-triggered cell cycle progression was attenuated at G1 stages by the addition of AAF (50 and 100 μM) with no inhibition of S to G2/M phase transition. These results suggest a mechanism of AAF-mediated immune suppression through a blockade of cell cycle progression from G1 to S phase, although it is not clear how AAF block the cell cycle progression.
On the other hand, the addition of exogenous interleukin 2 (IL-2, 100 or 200 units/ml) could not preclude this AAF-induced inhibition of lymphoproliferation. IL-2 activities, which were determined by using CTLL-2 cell line, in Con A-stimulated splenocyte culture supernatants at 48 hr were enhanced by AAF addition, while the activities of colony stimulating factor and tumor necrosis factor were decreased in a dose-dependent manner. Maximal activity of IL-2 was observed at 50 μM AAF, and its activities slightly declined when higher concentrations than 50 μM of AAF were treated to the cultures. This increase of IL-2 does not seem to be due to a leakage of IL-2 from intracellular IL-2 pool, because treatment of AAF, on the contrary of colchicne that has been known to increase the IL-2 activity in culture supernatant by inducing a modification of cytoskeletal structure, for the last 4 hr of a 2-day culture did not significantly increase IL-2 in the culture medium. In case of IL-2 receptor α(IL-2Rα) measured with 7D4, increase of the portion of IL-2Rα positive cell with Con A and IL-2 was inhibited by AAF, and so these data suggest that the IL-2 increase in culture supernatant may be partly from IL-2 accumulation which is due to this decrease of IL-2Rα. Additionally, the IL-2-dependent proliferation of splenocytes which were depleted of protein kinase C by preincbation with PMA (200 nM) was also inhibited by AAF. And IL-2-dependent proliferation of lymphoblastoid cells induced by PMA/ionomycin were also suppressed by AAF. The magnitude of AAF-mediated inhibition of proliferation with IL-2 was even higher than those when induced with Con A.
In conclusion, these results suggests that the immunosuppressive mechanism of AAF, which is different from AAF-mediated carcinogenesis, may be an attenuation Go/G1 to S phase progression, and this attenuation of cell cycle progression by AAF is thought to occur through blocking IL-2 receptor expression and signaling events triggered by IL-2.
본 연구에서는 발암 물질의 하나인 acetylaminofluorene (AAF)이 면역계에 미치는 영향과 그 기작에 대해 마우스 비장세포 배양을 이용해 알아보았다. AAF는 Con A나 PMA/ionomycine에 의해 촉진되는 비장세포의 증식과 alloantigen에 의한 혼합 림파구 세포 반응 (mixed lymphocyte response)을 투여량 의존적으로 저하시켰을 뿐 아니라 면양 적혈구를 항원으로 사용했을때 생기는 항체 생성 반응도 현저히 저하시켰다. 그에 반해 세포의 생존률, 단백질 합성능력, 그리고 글루타치온 양 등은 AAF 처리에의해 적은 감소를 보이거나 영향을 받지 않아 AAF의 면역저해 현상이 AAF의 cytotoxicity 때문에 발생하는 것은 아님을 보였다.
한편 면양 적혈구에 대한 항체 생성 반응이나 Con A에 의해 일어나는 세포 증식 반응은 AAF를 세포 배양 시작 초기 (24 시간 이내)에 가했을 때 가장 그 저해 효과가 높은 것으로 나타났다. Con A 처리 48 시간 후의 경우 고농도의 AAF (75나 100 μM)가 처리되어도 민감화 시작과 동시에 처리했을 때와 비교해 아주미약한 정도의 증식 저해 (20%이내)만이 관찰되었다. 마찬가지로 항체 생성반응의 경우에도 면양 적혈구에 대한 민감화 시작과 동시에 처리된 AAF (75와 100 μM)가 80% 이상의 반응억제를 보이는 반면 항원 민감화 시작후 48시간 또는 72시간후에 AAF (75 μM)가 처리된 경우는 억제효과를 볼 수가 없었다. Con A에 의해 유발되는 세포주기의 진행은 AAF를 가해주면 G1 phase 에서 세포 주기가 멈추어지는 것을 발견했으며 흥미롭게도 S phase에서 G2/M phase로의 phase transition은 영향받지 않았다.
면역반응 정도를 결정 짓는 가장중요한 요소중의 하나인 인터루킨2 를 가해주어도 AAF에 의해 저해된 면역세포 증식반응은 회복되지 않았다. Colony stimulating factor와 종양 궤사인자의 생성은 AAF 처리에 의해 투여량에 비례하여 감소되는 반면 비장세포 배양액 속의 인터루킨2 활성도는 AAF 처리에 의 해 오히려 증가되었고 최고활성도는 50 μM의 AAF가 처리되었을 때 관찰되었다. 75나 100 μM AAF에서도 인터루킨2 양의 증가가 나타났으나 50 μM의 경우와 비교할 때는 감소했다. 이러한 인터루킨2의 증가는 colchicine이 세포막 손상을 일으켜 세포내 pool로 부터 배양액으로 인터루킨2를 누출시키는 것과는 다르게 배양말기 4시간 동안의 AAF 처리에 의해 증가 되지 않았다. 또 하나의 중요한 요소인 인터루킨2 수용체는 AAF 처리에 의해 그 발현이 감소되었다. 따라서 면역저해 현상과 배양액 속의 인터루킨2 활성의 증가가 최소한 부분적으로는 인터루킨2 수용체의 발현 억제 때문이었음을 보여준다. PMA 전처리에 의해 세포내 protein kinase C가 제거된 비장세포와 PMA/Io에 의한 blast세포의 인터루킨2 의존형 세포증식 또한 이 AAF처리에 의해 현저하게 저해되었다.
이러한 결과들로부터 AAF에 의한 면역저해의 현상이 인터루킨2 수용체의 발현을 저해하고 인터루킨2의 중식신호의 전달을 막아 세포의 GO/G1 phase에서 S phase 로의 세포주기 진행을 방해하여 나타남을 알 수 있다.
