We have devepoped a new process for the recovery of a microbial poly(3-hydroxytu tyrates), PHB. Since the PHB-recovery step accounts for a large fractions of PHB production cost, the development of an efficient process is in need.
To take advantages of both differential cell digestion by hypochlorite and solvent extraction of PHB, we used dispersions of sodium hypochlorite solution and chloroform. Using the dispersions, we could obtain PHB of a high purity, a high molecular weight, and a high recovery. The produced PHB was identified by NMR study.
For Alcaligenes eutrophus, the treatment with hypochlorite alone caused so severe degradation that the molecular weight decreased drastically with increasing hypochlorite concentration. However, using the dispersions. the degradation of PHB was markedly diminished owing to the shielding effect of chloroform. In this case, we could obtain PHB of above 97% purity with a number average molecular weight ($M_n$) of 1,000,000 which was comparable to the original molecular weight of 1,200,000.
For the recombinant E.coli, the original number average molecular weight of PHB was 1,540,000 which was higher than that of Alcaligenes eutrophus. In this case, treatments with hypochlorite alone acused so mild degradation that the molecular weight decreased only slightly with increasing hypochlorite concentration.
To utilize lytic activity of bacteriophage for the recovery of PHB accumulated by recombianant E.coli, we used a $cI_{857}$ gene-depleted phage lambda. When the phage was introduced into the culture in the log-phase of growth, the cells were partially lysed. However, cell lysis in the stationary phase was negligible.
In addition to using a phage lambda for cell disruption, we tested E. coli strains containing temperature sensitive lambda lysogens. Cell lysis occured immediately after the addition of chloroform when the temperature was shifted from 36℃ to 43℃. We observed white unidentified solid material in the bottom and floating cell-debris. A fully lysed culture contained a considerable amount of bacterial debris. The lysis was also confirmed by light microscope. Scattered PHB granules were observed in the microscope.
기존의 플라스틱과 동일한 기능 및 특성을 지니면서도 생분해되는 PHA가 개발되어 현재 일부 회사에서 생산되고 있으나 생산단가가 비싸기 때문에 그 사용범위가 특수 목적에만 제한되고 있는 실정이다. 생산단가를 낮추기 위한 접근방법으로는 균주의 개발, 생물반응기 시스템의 최적화, 효율적인 분리정제기술의 개발 등이 있는데 실제로 분리정제에 드는 비용이 가장 크기 때문에 이에 대한 연구가 중요하다.
본 연구에서는 기존의 클로로포름 추출방법과 차아염소산나트륨을 사용하는 방법의 장점을 이용하기 위하여 클로로포름과 차아염소산나트륨을 동시에 섞어 사용하였다. 미생물은 친수성이고 PHB는 소수성이기 때문에 수용액 상에서 미생물이 파괴된 후, 유출된 PHB가 즉시 클로로포름 상으로 녹아들어가므로 비교적 쉽게 분자량이 높은 PHB를 얻을 수 있었다.
Alcaligenes eutrophus에 있어서는 차아염소산나트륨만을 사용하였을 때 분자량이 심하게 감소하였으나 클로로포름과 차아염소산나트륨을 동시에 섞어 사용하였을 때는 분자량 감소가 현저하게 줄어 들었다. 이 경우 순도가 97%이상, 수평균 분자량이 백만, 회수율이 80%인 PHB를 얻을 수 있었다. 그러나 E. coli에 있어서는 차아염소산나트륨만을 사용하여도 분자량 감소가 심하지 않았고 클로로포름과 차아염소산나트륨을 동시에 섞어 사용하였을 때는 분자량 감소경향이 Alcaligenes eutrophus의 경우와 비슷하였다.
유기용매를 사용하지 않고 PHB를 분리정제하기 위하여 $cI_{857}$ 유전자가 제거된 phage lambda를 두가지 방법으로 이용하였다. 먼저, PHB를 생산할 수 있는 재조합 대장균을 배양한 후 phage lambda를 직접 감염시켜 보았으나 결과가 만족스럽지 않았다. 그래서, PHB를 생산하는 유전자와 phage lambda 유전자를 동시에 지닌 대장균을 36℃에서 배양하여 PHB를 축적시킨 다음 온도를 42℃로 올려 세포파괴(autolysis)가 일어나도록 하였다. 클로로포름(2%) 을 첨가함으로써 세포파괴가 20분 이내에 급격히 일어나도록 할 수 있었다. 이 경우 플라스크 바닥에 하얀 가루가 쌓여 있었고 cell debris가 떠다니는 것을 볼 수 있었다. 현미경으로도 세포가 깨어진 것을 확인할 수 있었다.
본 논문에서는 PHB를 분리정제하기 위하여 클로로포름과 차아염소산나트륨을 동시에 섞어 사용하는 방법을 제안하였으며 유기용매를 사용하지 않고 PHB를 분리정제하기 위하여 phage lambda를 이용한 세포파괴법을 개발하였다. 클로로포름과 차아염소산나트륨을 동시에 섞어 사용하는 방법에 있어서는 보다 높은 회수율을 얻기 위한 실험조건의 최적화와 scale-up을 위한 더 많은 연구가 요구되며 phage lambda를 이용한 세포파괴법에 있어서는 분리된 PHB를 효과적으로 정제하기 위한 추가 공정의 개발이 요구된다.
