RNase P, the enzyme responsible for the biosynthesis of the 5'-termini of mature tRNA molecules in Escherichia coli, is composed of an RNA subunit (M1 RNA) coded by rnpB and a protein subunit (C5 protein) coded by rnpA. While M1 RNA can, by itself, carry out the catalytic reaction in vitro, both components are essential for the activity of RNase P in vivo. The accurate function of the C5 protein in vivo is unknown, but it has been assumed that M1 RNA biosynthesis depends on the synthesis of C5 protein. Using plasmids that could overproduce C5 protein upon induction with IPTG, we investigated effects of C5 protein on M1 RNA biosynthesis. To construct the plasmids, the rnpA gene was fused to the tac promoter of expression vector pKK223-3. About 40 bp DNA sequences coding the N-terminal region of C5 protein were chemically synthesized to keep the optimum distance between the S/D sequence of the vector and the translation start of the rnpA and to choose efficient codons. The plasmids also harbored the rnpB gene with the internal deletion which allowed us to directly examine M1 RNA transcription by analyzing metabolically unstable M1 RNA transcripts derived from the plasmids. The tac promoter expression system of the plasmids produced a high level of C5 protein upon induction with IPTG, but the overexpressed C5 protein had no significant effect on the M1 RNA transcription from plasmids.
대장균의 리보핵산 가수분해효소 P (RNase P) 는 tRNA 염가서열의 5'말단에서 전구체 tRNA를 절단하는 가공효소이다. 이 효소는 C5 단백질 이라고 부르는 단백질 성분과 M1 RNA라고 부르는 RNA 성분으로 되어있다. C5 단백질을 암호화하는 유전자는 rnpA 유전자이고, M1 RNA를 암호화하는 유전자는 rnpB 유전자이다. 시험관내에서는 M1 RNA 만으로도 촉매반응이 가능하지만 세포내에서는 M1 RNA 뿐만아니라 C5 단백질이 RNase P 활성에 꼭 필요하다. 그러나, 세포내에서 C5 단백질의 역할은 정확하게 밝혀지지 않았다. 비록 C5 단백질이 RNase P의 본질적인 기능인 촉매기능은 가지지 않지만, C5 단백질이 M1 RNA 생합성에 영향을 줄 것이라는 가정하에, 먼저 C5 단백질을 과잉생산할 수 있는 플라스미드를 제조하였다. 그 다음으로 제조된 플라스미드로 부터 과잉생산된 C5 단백질이 생체내에서 M1 RNA 생합성에 어떤 영향을 미치는 지를 조사하였다. C5 단백질을 과잉 생산하는 플라스미드를 재조하기 위하여 rnpA 유전자를 발현 벡타의 tac 촉진제에 융합시켰다. 이때 발현 벡타의 S/D 염기 배열과 rnpA 유전자의 번역 시작점 사이의 거리가 최적이 되고, 많이 쓰이는 코돈으로 바꾸기 위해서 C5 단백질의 N-말단 부위의 약 40개 염기들을 화학적으로 합성하여 이용하였다. M1 RNA 전사를 직접적으로 조사하기위해, 유전자 내부의 염기 서열이 일부 잘려진 rnpB 유전자를 같은 플라스미드에 삽입하거나 혹은 다른 종류의 플라스미드에 삽입하여 재조합된 rnpA 유전자를 포함하는 플라스미드와 함께 대장균에 형질변환 시켰다. 실험결과 tac 촉진제를 가지고 있는 플라스미드의 발현 시스템에 의한 C5 단백질의 생성은 IPTG에 의하여 다량으로 유발되었다. 한편, 과잉 생산되어진 C5 단백질은 플라스미드에 의한 M1 RNA 전사과정에는 영향을 미치지 않았다.
