Ribozymes are potentially very powerful agents for perturbing intra-cellular gene expression. Hammerhead structure ribozymes were designed to cleave the mRNA of hepatitis B virus X gene. Its cleavage was designed to result in the suppressed expression of lacZ fused to a 5' 462-bp fragment of X gene. The hammerhead ribozymes consist of a core region for cleavage activity and two variable regions for binding to a target RNA sequence. A target region of X mRNA was chosen among 12 GUC-containing regions, because it is predicted not to be base-paired by a computer algorithm of RNA secondary structure prediction. Each target-binding, variable region was designed to contain 4 matched bases near the core sequence and 4 2-base wobbles (matched and mismatched) in the rest. Among 256 possible sequences 12 sequences have so far been identified to yield suppressed expression of the fused lacZ. The β-galactosidase activities were reduced at least 10-fold. Also corresponding polypeptides were not produced as revealed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
식물의 감염원인 비루소이드, 바이로이드 등에서 유래하는 망치머리형 리보핵산효소는 그 구조적 요구가 간단하며 목표부위 선정이 용이하여 생체내 특정 유전자 발현을 저지하는 강력한 도구로 사용될 수 있다. 본 실험에서는 B형 간염 바이러스의 X 유전자 전령 RNA를 절단하도록 디자인하고, 그 구조를 합성하여 X-lacZ 융합 유전자 앞 부위에 그 서열을 수합하여 리보핵산효소의 작용 여부를 베타 갈락토시다아제의 활성 측정으로 알아볼 수 있게 하였다.
그 산물이 바이러스 또는 고등 세포의 전사를 촉진한다고 알려진 X 유전자는 462개의 염기서열로 이루어져 있으며, 이 염기서열 중 리보핵산 효소의 작용 부위로 알려진 GTC 염기서열이 12개 존재하고 있다. 이 중 컴퓨터 알고리즘을 통해 자체적인 이차구조를 가지고 있지 않다고 예측되는 부위를 공격목표로 설정하고, 절단에 필수적인 리보핵산효소의 특정구조 양 옆으로 각 8개씩의 염기가 목표부위와의 결합에 이용되도록 하였다. 이 때 양 말단의 4개 염기가 완전결합 또는 불완전한 결합을 하도록 하여 이 부위의 wobble이 리보핵산효소의 작용에 미치는 영향도 알아볼 수 있게 하였다.
위와 같이 공격부위 선정, 리보핵산효소의 디자인 및 이에 필요한 수합을 마친 후에는 X-gal plate 상에서 작용을 보이는 리보핵산효소를 선택하였다. 256개의 가능한 염기서열 중 12개의 리보핵산 염기서열을 밝혀 내고, 이들의 베타 갈락토시다아제 활성이 최소 10배이상 감소함을 알아 내었다. 이로부터 리보핵산효소의 결합부위의 wobble이 허용된다는 사실과 함께 이를 리보핵산효소의 trans-action 에 있어 binding coefficient 조절에 이용할 수 있다는 가능성을 알아 내었다. 또한, X-lacZ 융합 단백질이 생성되지 않는다는 것도 SDS-polyacrylamide gel 을 통해 확인하였다.
