Streptokinase (SK) is an extracellular protein produced by many strains of hemolytic streptococci, which lyses blood clots by activating plasminogen to plasmin. The mechanism of poasminogen activation by streptokinase had long been investigated, however, there are little reports about the three dimensional structure of streptokinase and its interaction with plasminogen in detail. Recently, it was reported that C-terminal amino acids of streptokinase may have potential importance in structural and functional aspects. To elucidate the structural and functional roles of C-terminal amino acids of streptokinase, several C-terminal deleted streptokinase genes were constructed by nested deletion of streptokinase coding gene with exonuclease III. The C-terminal deleted streptokinases were expressed in E. coli and purified by affinity chromatography using plasminogen-coupled Sepharose 4B. DSK33 (mutant SK lost 33 amino acids from the C-terminus of a native SK) and DSK40 behaved like as a native SK in the column. On the other hand, DSK46 showed a smaller peak than a native streptokinase and DSKs lost 47 residues or more did not bind to the column. CLN hydrolysis test of purified DSKs showed that 40 residues deletion from the C-terminus did not affect the activation activity. However, deletion of 46 or more amino acids resulted in dramatically reduced plasminogen activation activity. These results propose that residues 40 to 47 from C-terminus consist in a binding site of streptokinase with plasminogen.
스트렙토키나제 (streptokinase)는 혈전증 치료제로서의 유용성과 독특한 작용기작 때문에 오랫동안 연구되어왔다. 분자수준에서 Streptokinase의 구조와 기능에 관한 연구결과는 거의 보고된바 없으나 최근 이 단백질의 C-말단 부위가 기능에 중요하다는 보고가 있어 이를 규명하기 위해 이 단백질의 C-말단 부위가 순차적으로 절단된 일련의 돌연변이 유전자를 만들었다. 본 연구에서는 이들 유전자로 부터 C-말단이 절단된 돌연변이 스트렙토키나제를 발현 및 정제하였으며 C-말단의 절단이 스트렙토키나제 활성과 plasminogen과의 결합에 미치는 영향을 조사 하였다. Plasminogen-coupled Sepharose 4B 컬럼을 이용한 affinity chromatography 수행시 C-말단으로 부터 40 잔기이하가 절단된 돌연변이 streptokinase는 야생형과 비슷한 양상으로 컬럼에 결합하였으며 46잔기가 제거된 돌연변이 스트렙토키나제는 야생형보다 약한결합을 보였다. 한편 47잔기 이상이 제거 된 돌연변이 스트렙토키나제들은 전혀 결합하지 않았다. 정제된 돌연변이 streptokinases의 활성을 조사한결과 C-말단의 40개 아미노산 잔기가 제거되어도 plasminogen 활성화에는 영향이 없었다. 그러나 46개의 잔기가 없어 지면 활성화능력이 급격히 떨어짐을 알 수 있었다. 이와같은 사실들은 C-말단 으로 부터 40에서 47번의 아미노산 잔기들이 Streptokinase 활성에 중요하며 이들잔기들이 plasminogen과의 결합에 관여 할 가능성을 시사해준다. 스트렙토키나제의 이차구조 예측결과에 의하면 이 부위 잔기들은 β-turn 구조를 이루며 연이어 (+) 전하를 갖는 Lysine과 Arginine이 위치하는데 이 β-turn구조와 전하가 plasminogen과의 결합에 관여 하리라 예상된다. 이러한 가능성을 연구하기 위해 PCR (Polymerase Chain Reaction) 을 이용한 site specific mutagenesis를 통하여 4종류의 돌연변이 스트렙토키나제 유전자를 만들었으며 현제 이들의 Sequencing과 발현실험을 수행중이다.
