Despite the importance of $\underline{Micromonospora}$ for its production of invaluable antibiotics, very little is known about its genetics. Due to their non-conidia forming properties, mycelial fragment and protoplast were used for the studies.
By the assessment of the mutation of $\underline{M}$. $\underline{rosaria}$ to streptomycin-resistancy, the best conditions and effective procedures for the mutagenesis by a chemical mutagen, MNNG, have been determined. Mutation was efficiently induced when mycelial fragments were treated with MNNG at the concentration of 0.3 to 0.5 mg/ml in the reaction buffer of pH 7.0. Optimal treatment time was 30-40 min. Ampicillin treatment was very effective for concentrating the portion of auxotrophs. By the determined procedure, more than 30 mutants have been isolated, characterized, and used for this study. When protoplasts were treated with MNNG, as much as 4% of the resultant colonies were auxotrophic mutants.
Conditions for efficient formation and regeneration of $\underline{M}$. $\underline{rosaria}$ protoplasts were investigated. The state of inoculum, culture stage and growth in a medium containing partially growth-inhibiting concentration of glycine have significant effects on protoplasting. It seems that growth stage as well as the growth rate are most critical factors for the efficient protoplasting. A high frequency of regeneration (up to 30%) was accomplished with a hypertonic regeneration agar medium. A slight difference in the optimal culture age for the formation and regeneration of protoplasts was found. Using these optimal conditions, protoplast fusion was carried out. When single auxotrophs were used in protoplast fusion by PEG 1,000, the recombinant frequency varied from 1.3 to 5.9%. Using two double auxotrophs, MR 28 and MR 217 whose genotypes are $\underline{ros}^-$ $\underline{his}$ $\underline{trp}$ and $\underline{ros}^+$ $\underline{arg}$ $\underline{ura}$, respectively, fusion conditions were optimized. Various pairs between multiple auxotrophs were shown to be effectively fused under the optimized conditions. Appearing prototrophic colonies were found to be true recombinants. Additionally, when $ros^-$(not producing) strains were crossed by protoplast fusion, about up to 5% of the resultant prototrophic recombinants were shown to have restored $ros^+$ (producing) character. And higher-producing strains could be isolated by protoplast fusion.
Electron microscopy showed stable and intact protoplasts when they were prepared with a hypertonic buffer. But many protoplasts were shown to be damaged and many membraneous vesicles were observed when prepared in buffer without sucrose. When PEG-treated protoplasts were observed by electron microscope, fusion bodies in each stage of fusion were observed.
Protoplasts was used for the curing experiment of $\underline{M}$. $\underline{rosaria}$ and $\underline{M}$. $\underline{purpurea}$. It was much more effective than mycelial fragment for detecting the cured strains. It was to be noted that the curing phenomenon was found to be strain-dependent. When protoplasts of some mutants and cured strains were fused and analyzed, it was shown that at least some structural genes for the rosamicin biosynthesis are located at chromosomal DNA. The curing phenomenon (frequent loss of $ros^+$ by AF treatment) of $\underline{M}$. $\underline{rosaria}$ may not be explained by the simple loss of plasmid but by some kind of chromosomal rearrangement.
방선균 가운데 마이크로모노스포라 속에 속하는 미생물 들은 그들이 생성하는 중요한 항생제 들에도 불구하고 학문적으로 소외되어 왔으며, 특히 유전학적 연구는 거의 불모의 상태에 있다. 이 가운데서 M. rosaria 와 M. purpurea 는 각각 로자마이신과 젠타마이신의 생성 균주로서 포자 형성이 극히 미비하기 때문에 이들의 유전학적인 연구를 수행하기 위해 인 위적으로 균사 조각과 protoplast 를 유도하여 실험하였다.
먼저 본 연구에 필요한 여러 돌연변이체를 효과적으로 유도하고 또 관련된 다른 균주들에 대해서도 사용할수 있게 하기 위하여 화학 유발물질인 MNNG 를 사용하여 돌연변이 유발조건을 결정하였다. 완충용액의 수소 이온 농도를 7.0 정도로 조정하고, MNNG 의 농도를 0.3 - 0.5 mg/ml 로 하여 30 - 40 분 정도 처리해 줄때 매우 효과적으로 돌연변이가 유발되었으며 ampicillin 처리에 의해 영양 요구주 들의 비율을 더욱 높일수 있었다. 이때 M. rosaria 를 인위적으로 자른 균사체 조직으로써 실험 하였으며 평균 한개의 균사체 조각은 16개 정도의 세포를 갖고 있었다. M. rosaria 는 다른 박테리아 들에 비해서 MNNG 에 매우 민감한 반응을 보였으며 생화학적 으로 주변 환경인자에 매우 약한 미생물 이었다. 30 여개의 유용한 돌연변이체가 선발되어 분석 되었으며 본 연구에 사용되었다. 한편 MNNG 를 protoplast에 처리하여 실험해 본 결과, 약 4% 까지 영양 요구 돌연변이를 얻을 수 있었다.
Protoplast를 효과적으로 유발하고 다시 균사 형태로 환원 시키기 위하여 조건을 조사하였다. Inoculum 의 상태, 성장 단계, 배지에 glycine을 넣어서 부분적으로 성장을 억제하는 것 등이 매우 중요하였다. 다시 말하면, 성장의 단계와 성장 속도가 효율적인 protoplast 생성을 위해 서 가장 중요한 요소로 보여졌다. Protoplast의 환원을 위해 배지 성분을 체계적으로 조사하여 기존의 배지를 약간 조정하여서 30% 정도의 M. rosaria protoplast가 환원되는 조건을 결정하였다. 이 조건들을 사용하여 protoplast 융합 실험을 수행하였다. 분자량 1,000 의 PEG 를 사용하였으며 단일 영양 요구주들 간에 실험했을때 재조합 빈도는 1.3 - 5.9% 정도였다. 이중 영양 요구주 MR 28 과 MR 217 균주를 써서 융합 조건을 보다 최적화 하였다. 이때 분자량 1,000 의 PEG 가 채택 되었고 50%(w/v)의 농도로 했을때 가장 좋았으며 처리 시간은 3 - 5 분으로 결정 되었다. 이 조건으로 다른 여러 이중 혹은 그 이상의 영양 요구주 간의 융합이 매우 높은 빈도로 유발 되었다. 이때 나타나는 정상화 균주들은 true recombinant 들임이 입증되었다.
전자 현미경으로 조사한 결과 hypertonic buffer 로 준비된 protoplast 들은 매우 안정되고 확실한 protoplast 들임이 확인 되었으며, 그들의 미세 구조가 밝혀졌다. 그러나 그들이 sucrose 를 고농도로 첨가하지 않은 일반 완충용액으로 준비 되었을때 매우 많은 membraneous vesicle 들이 protoplast 내, 외에 존재하고 있었다. PEG 로 처리된 protoplast들을 전자현미경으로 찍었을 때 각 fusion 단계에 있는 여러 fusin body 를 관찰할수 있었다.
Protoplast는 또한 plasmid 의 존재를 밝히는데 쓰는 curing experiment 에 효과적으로 사용되었다. 그 결과 특정한 돌연변이 균주에서만 $ros^+$ 성질이 높은 빈도로 상실되는 현상이 관찰되었다. 그리고 항생제 생성 불능에 관계된 돌연변이체 들은 융합하여 그 결과로 선발된 재조합 균주들을 조사, 분석한 결과 최소한 몇개의 rosamicin 합성에 관계된 유전자가 chromosome 에 위치하고 있다는 것을 알 수 있었다. Protoplast 융합으로 분석한 결과 acriflavine 은 plasmid의 상실에 의해서가 아니고 chromosome 혹은 plasmid 의 재 배치 (rearrangement) 에 의해 ros-를 유발할수 있다는 가능성을 시사 하였다.
세포융합 기술은 M. rosaria 균주에 있어 다수의 재조합 균주를 유발 시켰으며 이들 가운데 2 개의 생성 우수 균주로 입증되었다.
