(Part 1)
Purification and Characterization of Pseudomonas fluorescens SIK W1 Lipase Expressed in Escherichia coli
Pseudomonas fluorescens SIK W1 lipase was expressed as a form of inclusion bodies in Escherichia coli, which was equivalent to 46 % of total cell protein. The inclusion bodies isolated from other cell components were solubilized in the buffer containing 8 M urea and then refolded by diluting urea. The lipase with active conformation was purified by hydrophbic interaction chromatography, gel filtration, anion-exchange chromatography and hydroxyapatite chromatography from the refolded sample. By these purification steps, a single band for active lipase was detected on non-reducing SDS-PAGE and 10-fold purification was attained on the basis of specific activity. Specific activity of the purified lipase toward olive oil emulsion was found to be 7,395 units per mg protein. The optimum pH and temperature of the lipase were pH 8.5 and 45-55℃, respectively. The lipase showed higher lipolytic activity toward tricaproin ($C_6$) and tricaprylin ($C_8$) among the triglycerides examined and preferentially hydrolyzed ester bond of 1- and 3- position of triolein. Lipase activity was greatly increased approximately 6-fold and stability for pH was shifted to alkaline pH by $Ca^{2+}$ ion. The lipase was inhibited by $Hg^{2+}$, $Ag^{2+}$, p-chloromercuribenzoate, diethylpyrocarbonate and sodium dodecyl sulfate.
(Part 2)
Enhancing in vitro Refolding Yied of Pseudomonas fluorescens Lipase Expressed as Inclusion Bodies in E. coli
To enhance in vitro refolding yield of Pseudomonas fluorescence SIK W1 lipase expressed as inclusion bodies in E. coli, various refolding conditions were investigated, protein concentration, oxidoshuffling condition, guanidine hydrochloride (GdnHC1) concentration pH, activator (calcium ion), temperature and dilution mode. Refolding efficiency was optimal at protein concentration of 40-100 and 20-50 ㎍/ml in the presence of 0.8 and 0.2 M GdnHCl, respectively. At the higher concentration, refolding yield was decreased with the increase of protein concentration, which was reflected by the formation of aggregates. Oxidoshuffling condition required to generate disulfide bond had no effect on the refolding. Intermediate concentration of GdnHCl(0.7-1.0M) increased final yield of the active lipase. pH optimum for refolding of the lipase was interdependent on GdnHCl concentration. While the refolding yield was maximum below pH 7.0 under 0.8 M GdnHCl, the refolding under 0.12 M GdnHCl was efficient at alkaline pH above 10, which suggests that alkaline pH could complement mild denaturing effect of intermediate GdnHCl concentration. Calcium ion, activator of the lipase, was essential for refolding process of the lipase. The refolding was optimal at the low temperature below 10℃ and formation of aggregates was increased above 20℃ because hydrophobic interaction was enhanced at higher temperature. Refolding was very rapid process and thus refolding yield was affected by mixing mode. Refolding efficiency under optimal conditions as described above was about 70 % on the basis of specific activity.
Refolding by cumulative addition of unfolded lipase was very efficient on diminishing aggregation at a high protein concentration, compared to batch-wise refolding process. By this strategy, it was found that protein concentration within refolding medium could be reached up to 0.9 mg/ml without reduction of refolding yield. Soluble form pre-existing within the refolding medium protected adsorption of the lipase on being refolded to the container and served as physical barrier to interaction between refolding intermediates. The role of soluble form was quite different from that of Sec B which actively suppressed aggregation at high protein concentration. It was expected that refolding by cumulative addition probably cut down the cost of downstream refolding process because further concentration step is not required and only smaller refolding medium is needed.
(대장균에서 발현된 Pseudomonas fluorescens SIK W1 리파제의 분리정제 및 특성파악)
Pseudomonas fluorescens SIK W1 유래의 리파제는 대장균에서 inclusion body 형태로 발현되었고 총대장균 단백질의 46 %에 해당하는 리파제가 생성되었다. 다른 세포성분으로 부터 분리한 inclusion body 를 8M urea로 용해시킨 후 urea를 희석하여 활성회복 (refolding)을 수행하였다. 활성회복된 리파제의 시료로 부터 네 단계의 column chromatography를 통해 활성 리파제만을 순수하게 정제하였다. 정제과정에서 정제순도가 10배 정도 증가하였고, 기질로써 올리브유 에멀젼을 사용했을때 정제된 리파제의 specific activity는 mg 단백질당 7395 unit였다. 이 리파제의 최적 pH 와 온도는 각각 pH 8.5 와 45-55℃ 였다. Triglyceride 들중 tricaproin ($C_6$)와 tricaprylin ($C_8$)에 대해서 높은 가수분해활성을 보였고, triolein에 대한 위치특이성에 있어서는 1번과 3번 위치에 대해 우선적인 특이성을 보였다. 칼슘이온 존재하에서 리파제의 활성이 6 배 이상 증가하였고 동시에 염기성 pH에서의 안정성이 증대되었다. 또한 본 리파제는 금속이온들중 $Hg^{2+}$와 $Ag^{2+}$ 이온에 의해 활성이 억제되었고, 효소억제제중 p-chloromercuribenzoate와 diethylpyrocabonate 및 SDS에 의해 활성이 감소되었다.
(대장균에서 inclusion body 형태로 발현된 Pseudomonas fluorescens 리파제의 활성회복 수율의 증진)
대장균에서 inclusion body 형태로 발현된 Pseudomonas fluorescens SIK W1 리파제의 활성회복 (in vitro refolding)을 증진시키기 위해 단백질 농도, disulfide 결합의 재형성 조건, guanidine hydrochloride (GdnHCl) 농도, 활성촉진제인 칼슘이온, 온도 및 희석 양상등의 영향에 의한 활성회복 수율을 조사하였다. 리파제의 활성회복에 최적인 단백질 농도는 GdnHCl 농도에 영향을 받았고, 0.8 M GdnHCl 존재시는 40-100㎍/ml, 0.2 M GdnHCl 존재시는 20-50㎍/ml이 최적이었다. 이보다 높은 단백질 농도에서는 응집체 (aggregate)가 재형성때문에 활성회복 수율이 감소하였다. disulfide 결합의 재형성에 필요한 조건은 활성회복에 영향을 주지 않았고 최종 GdnHCl 농도는 0.7-1.0 M이 최적이었다. 최적 pH는 GdnHCl의 농도에 따른 상호 연관성을 보였는데, 0.8 M GdnHCl 존재하에서는 pH 6.5 정도가 최적이었고 0.12 M의 낮은 GdnHCl 농도에서는 pH 10 이상의 알칼리성 pH가 효과적이었다. 이 리파제의 활성촉진제인 칼슘이온은 활성회복과정에도 절대적으로 필요하였고 최적농도는 10mM이었다. 10℃ 이하의 온도에서 활성회복이 최적이었고 20℃ 이상에서는 응집체의 재형성때문에 활성회복 수율이 급격히 감소하였다. 활성회복은 대단히 빨리 진행되는 과정이기 때문에 희석 양상에 의해 활성회복 수율이 영향을 받았다. 이상에서 조사된 최적 조건하에서 리파제의 활성회복 수율은 specific activity 기준으로 약 70 % 였다.
활성회복을 위한 완충용액내로 unfolding된 리파제를 추가적으로 첨가하였을때 높은 단백질 농도에서도 응집체의 재형성을 감소시킬 수 있었고, 따라서 높은 활성 수율을 지닌 고농도의 리파제 시료를 얻을 수 있었다. 즉 이 방법에 의해 0.9 mg/ml 단백질 농도에서 50 %이상의 활성 수율을 지닌 리파제를 얻을 수 있었다. 완충용액에 이미 존재하고 있던 활성 리파제는 활성회복이 진행중인 리파제가 용기에 흡착되는 것을 막아주었고, 이와 같은 역활은 높은 단백질 농도에서 응집체 형성을 억제하는 SecB의 역활과는 달랐다. 따라서 unfolding된 단백질의 추가적인 첨가에 의한 활성회복 방법은 차후에 농축과정이 필요치 않고, 적은 부피의 완충용액이 요구된다는 점에서 대량의 활성회복공정에서의 경비절감에 이로울 것으로 기대된다.
