Phosphoinositide-specific phospholipase C(PLC) is a crucial enzyme in transmembrane signaling. Six mammalian PLC isozymes including PLC-β1, PLC-β2, PLC-γ1, PLC-γ2, PLC-δ1, and PLC-δ2 have been identified at both protein and DNA levels.
All mammalian PLC sequences contain highly conserved two domains, designated as X and Y. Degenerate PCR primers corresponding to consensus sequences of X and Y domains were synthesized to probe new type of PLC-β family. A PCR product from a rat brain cDNA library that contain a PLC-like sequence distinct from those of the corresponding regions of known PLC isozymes was obtained. The cloned PCR product was used as a probe to screen rat libraries. Two different cDNA clones and a genomic clone were isolated from FRTL-5 cDNA, brain cDNA, and genomic libraries. The whole cDNA and the region corresponding to the amino terminal part of the new PLC gene were sequenced. The two cDNA sequences were identical except that the 201 nucleotide (67 amino acids) long DNA fragment in the shorter one was deleted from the larger one. The larger cDNA consists of 4,176 nucleotides and contains a single reading frame that encodes 1,234 amino acids. The open reading frame of the shorter one was not shifted. The deduced amino acid sequence of the new PLC cDNA was similar in primary structure and overall structural organization to known PLC-β isoforms. The amino acid sequence of the new PLC was more similar to that of PLC-β1 than to that of PLC-β2. The new PLC was named, PLC-β3.
Antibodies against PLC-β3 were raised using four different peptides corresponding to different parts of the PLC-β3 amino acid. Immunoblotting assay showed that a PLC-β3 like protein is present in various rat tissues. It was abundant in parotid gland, brain, and liver. Relatively small anount of PLC-β3 was also present in uterus, lung, heart, adrenal gland, and ovary tissues. However, levels of PLC-β3 presenting various tissues of rat were approximately 100 times less than PLC-β1.
Phosphoinositide-specific phospholipase C(PLC)는 막을 통과하는 신호전달에 중심적 역할을 하는 효소로서, 지금까지 여섯가지의(PLC-β1, PLC-β2, PLC-γ1, PLC-γ2, PLC-δ1, and PLC-δ2) 동질효소(isozyme)들이 발견되었다. 이 동질효소들의 아미노산 서열에는 보존성이 높은 X 와 Y 라고하는 부분이 있는데, 이 특징을 이용하여 새로운 PLC-β클론을 찾아내었다. 새로운 PLC를 찾기위한 탐침을 만들기 위해 X 와 Y 부분의 보존된 아미노산 서열에 상응하는 primer들을 합성하여 쥐의 뇌조직 cDNA library에서 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 중합효소연쇄반응의 산물들을 분석하여 아미노산서열이 다른 PLC 동질효소들에 상응하는 부위와 유사한 하나의 클론을 얻었고, 이를 이용하여 FRTL-5 세포와 뇌의 cDNA library에서 두가지 클론을 얻었으며 genomic library에서 한가지의 클론을 얻었다. cDNA 전체와 아미노말단에 해당하는 genomic 클론에 대한 염기서열을 결정하여 분석한 결과 두가지 cDNA 클론의 염기서열은 짧은것에 201개의 염기서열(67개의 아미노산)이 빠져있는 것을 제외하고는 동일하였으며, 긴 cDNA 클론은 4,176의 염기서열로 구성되어 있었고, 1,234개의 아미노산 서열로 이루어진 하나의 open reading frame을 가지고 있었다. 이때 짧은 cDNA 클론의 open reading frame은 바뀌지 않고 길다란 클론과 같은 frame에 있었다. 새로운 PLC cDNA로 부터 유추한 아미노산 서열은 일차구조와 domain 구조에서 PLC-β의 동질효소들과 유사하였는데 특히 PLCβ2 보다는 PLC-β1과 더많은 유사점이 있었다. 새로 발견된 PLC를 PLC-β3라고 명명 하였다.
PLC-β3가 조직에 따라 어떻게 분포하는 가를 알아보기 위하여 PLC-β3 아미노산 서열에 상응하는 네가지 다른 peptide들에 대한 항체를 만들었다. 이 항체를 이용하여 immunoblotting 방법으로 여러 조직에 대하여 조사한결과 귀밑샘, 뇌, 그리고 간에 많은 양이 존재하였고 자궁, 폐, 심장, 부신, 그리고 난소에는 소량으로 존재하고 있음을 알게 되었다. 그러나 대체적으로 조직마다 PLC-β3의 양은 PLC-β1의 양보다 100배 정도 적게 나타났다.
