When in contact with phospholipid vesicle, in acidic pH, a short C-terminal stretch of cytochrome c is protected from the tryptic digestion while a longer C-terminal segment of apocytochrome c is protected from the digestion.
We investigated the structural difference of the fragment contained tryptophan-59 residue in two protein.
Flexibility of the fragment was measured by hydrogen exchange rate of imino proton of tryptophan, using 300 MHz NMR. The imino proton of Trp-59 in apocytochrome c was assigned newly in this report by NOE experiment.
The imino proton of Trp is labile, exchangable with solvent, proton. The exchange rate of imino proton with solvent depends on solvent accessibility and hydrogen bonding. It was observed that the fragment contained Trp-59 in apocytochrome c is about $10^6$ times as flexible as the fragment in cytochrome c. And cytochrome c was more flexible at pH 5 than at pH 7.
UV/VIS spectroscopy method was performed to measure the rate of oxido-reduction of cytochrome c depending on pH. Reduced cytochrome c is more stable at neutral pH than acidic pH.
From these results, we concluded that flexible structure of two proteins at acidic pH is important to interact with vesicles, to act as a cofactor of electron transfort systems.
Cytochrome c 가 인산지방질막과 상호작용할 때 C-terminal부분이 인산지방질막과 결합하는 반면에 apocytochrome c 는 cytochrome c 보다 더 긴 C-terminal부분이 막을 통과함이 알려져있다. 특히 55번째 잔기로부터 80번째 잔기의 경우 cytochrome c 에서는 막과 결합하지 않으나 apocytochrome c 에서는 막과 결합한다. 이 실험에서는 300 MHz NMR을 이용하여 tryptophan-59 잔기부근의 구조가 두 단백질에서 어떤 차이가 있는가를 hydrogen exchange (수소교환) 실험을 하여 알아보았다. Tryptophan 의 side chain 에 있는 indole NH 수소는 물에 노출된 정도와 수소결합 여부에 따라 수소교환속도가 결정된다. Cytochrome c 의 수소교환속도는 pH 4-8 영역에서 반감기가 수시간이고 apocytochrome c는 cytochrome c보다 $10^6$ 정도 빨랐다.
Apocytochrome c 의 경우는 tryptophan indole NH의 peak 위치를 알기위해 NOE 실험을 하였으며, 그 결과 10ppm 임을 밝혔다. 위 결과로부터 cytochrome c 의 경우는 tryptophan을 포함하는 부분이 단백질의 다른 부분과 강하게 결합하여 인산지방질막과 결합하기 어렵고, apocytochrome c 경우는 그 부분이 완전히 노출되어 막과 쉽게 결합할 수 있음을 알았다.
또 UV/VIS spectroscopy 방법을 이용하여 cytochrome c 의 산화속도가 pH에 따라 어떤 차이가 있는가를 보았다. 그 결과 중성에서보다 산성에서 빠르게 산화함을 알았다. 이것은 cytochrome c 가 전자전달계에서 작용할 때 주위의 pH에 따라 구조를 변화시켜 알맞은 활성을 유지함을 암시한다.
