In Bacillus subtilis, many genes responsible for hyperproduction of extracellular enzymes have been reported and new ones are expected to be exist. prt R gene, for example, encodes a 60-amino acid polypeptide and can enhance the transcription of neutral and alkaline proteases and levansucrases.
To clone prt R gene or other genes which has pleiotropic effect, a system was developed in which those genes could be cloned by simple Cm-selection. But this system was turned out to be unreliable because small portion of cells showed greatly enhanced Cm-resistancy.
Using $^{32}P$-labelled oligonucleotide as a probe, one colony showed positive signal in colony hybridization. The recombinant plasmid contained a 1.65 kb fragment. When subcloned into B. subtilis MI112 cells, moderate change of production of extracellular proteases was detected on skim-milk plate. Further characterization should be needed.
고초균에서 세포밖으로 분비되는 단백질의 양을 증가시키는 유전자를 phenotypic selection 으로 간단하게 클로닝 할 수 있는 system을 만들기 위하여 고초균의 세포내에서 염색체에 integration 할 수 있는 플라스미드, pSH102를 제조하였다. pSH102로 Bacillus subtilis DB104 균주에 형질전환시켜 pSH102가 염색체의 서브틸리신 유전자 부위에 integration된 균주인 Bacillus subtilis CT102를 얻었다. pSH102 내에는 chloramphencol acetyl transferase(cat) 유전자가 서브틸리신 promoter에 의해서 전사된다. 또한 염색체에 integration 되어있으므로 cat유전자의 copy수는 하나가 되기 때문에 CT102 균주는 chloramphenicol에 대하여 10 μg/ml의 최소저해농도값을 갖는다. 세포밖으로 분비되는 효소들의 양을 증가시키는 유전자들의 대부분은 서브틸리신 promoter에도 작용하는 점에 착안하여 CT102 균주를 형질전환 시킨 후 선별을 60 μg/ml의 chloramphenicol농도에서 수행하였으나 일부분의 균들이 매우 향상된 저항성때문에 실패하였다. $^{32}P$-labelled oligonucleotide를 탐침으로 사용하여 colony hybridization 실험을 수행한 결과 하나의 transformant가 positive signal을 보였다. 이 transformant에서 플라스미드를 분리하여 agarose gel electrophoresis를 하여 분석하였다. 이 플라스미드는 약 1.6 kb의 insert를 가지고 있었으며 Bacillus subtilis MI112 균주에 subcloning 하였을 때 단백질분해효소 생산의 증가를 TBAB skim milk plate 상에서 확인할 수 있었으나 정확한 확인을 위해서는 정량적인 실험 및 확인작업이 필요하다.
