Exo-β-1, 4-glucanase was previously cloned from C. thermocellum in our laboratory. For overproduction, This gene was subcloned into the expression vector pKK223-3 which contains tac promoter. The plasmid pKM29 containing exo-β-1, 4-glucanase was digested partially with EcoRI and ligated with EcoRI digested vector. Those ligated mixtures were used to transform E. coli JM103. From the transformants, the desired transformant was isolated and plasmids were purified. It was named pTK29. The tac promoter may be controlled with IPTG. When the culture of E. coli (pTK29) was grown in LB broth to $O.D_{600}$ of 0.5, IPTG was added. The production of exo-β-1, 4-glucanase was enhanced and maximum specific activity of this enzyme on induced state was 7 times higher than that of on uninduced state. The molecular weight of exo-β-1, 4-glucanase was about 66kD. In the cell, Produced polypeptide processed to smaller, at least, four types which still retain activity.
이미 본 실험실에서 클론닝된 Clostridium thermocellum의 exo-β-1,4-glucanase의 효소적 특성분석과 활성면에서 더 좋은 효소로 조작하기 위한 전초작업으로 대장균에서 발현용 벡터인 pKK223-3에 서브클론닝하였다. 이 벡터는 tac promoter를 가지고 있어 전사단계에서 강력한 능력을 보일 뿐만 아니라 IPTG로 그 발현을 조절할 수 있다. 섬유소 분해효소가 제대로 들어 간 플라스미드를 pTK29라 명명하였고 이 플라스미드를 가지는 대장균을 가지고 효소생산 유도 실험을 수행하였다. 600 nm에서 흡광도가 0.5일때 IPTG를 처리하면 성장속도가 감소하는 반면 효소 생산량은 증가하여 3시간 동안 지속되었다. 3시간 후의 특이효소활성도는 초기 IPTG 처리 전 보다 7배가 증가하였고 처음 클론된 균주보다 3배가 높은 값을 나타내었다. SDS-PAGE로 확인된 이 효소의 분자량은 66,000으로 보여 지는데, 생산 되어지는 이 효소들은 더 작은 단백질로 잘려져 그 분자량은 62000, 48000 등으로 여전히 효소활성을 지니고 있었다."
