To understand the transcription initiation mechanism in psychrophilic bacilli and achieve a DNA fragment exerting strong promoter activity in B. subtilis, a B. subtilis/E. coli promoter probe shuttle vector by ligation of promoterless cat-86 gene and B. subtilis/E. coli shuttle vector, pZ124 has been constructed. This plasmid, pZC101, was stably maintained in both species but only kanamycin resistance gene was expressed and sensitive to 30 μg/ml chloramphenicol in Bacillus subtilis. Using this promoter probe vector, 55 promoter clones from two Bacillus species, B. subtilis JU70 and B. insolitus ATCC23299(psychrophile) were obtained. By examination of chloramphenicol resistance on solid media, SDS-PAGE analysis, RNA dot-blots, and CAT specific activity, some of the promoter clone, such as pI1 have 3 fold higher CAT specific activity than control promoter SPOII at 37℃ growth.
저온성 bacilli 의 전사개시작용을 알아보고, 고초균내에서 강한 promoter 활성을 지니는 DNA 단편을 클로닝하기위해, 고초균과 대장균에서 안정하게 유지되는 promoter 검색 vector, pZC101을 만들었다. 이 vector는 promoter를 검색하는 선택 marker로 promoter가 결여된 cat-86 클로람페니콜 내성 유전자를 가지며 카나마이신 유전자만 발현되고 30 μg/ml 클로람페니콜 농도에서 고초균을 자라지 못하게한다. 이 promoter 검색 vector를 이용하여 B. subtilis JU70과 B. insolitus ATCC23299의 두 균주로부터 고초균내에서 30 μg/ml의 클로람페니콜 농도에 내성을 부여하는 55개의 DNA 단편을 클로닝하였다. 이 DNA 단편의 promoter 활성을 알아보기 위해 고체배지에서의 클로람페니콜 내성정도, SDS-PAGE gel 상에서 클로람페니콜 아세틸 전이 효소의 양, RNA dot blot, 클로람페니콜아세틸 전이 효소의 비활성을 조사하였다. 이 DNA 단편들에 의해 유도되는 클로람페니콜의 최소 저해 농도는 고체 배지 ml 당 60-120μg 이었고 SDS-PAGE gel상에서 과량생산된 클로람페니콜 전이 효소를 발견하였다. 또한 RNA dot blot을 통해 클로닝한 DNA 단편이 클로람페니콜 전이 효소에 대한 m RNA의 발현을 유도함을 확인하였다. 클로닝한 DNA 단편들의 클로람페니콜 전이 효소 비활성은 370 mU 에서 12,800 mU에 걸쳐 나타났는데 이중 pI1 DNA 단편은 강력한 promoter라 알려진 spoII promoter에 비해 3배 강한 비활성을 나타냈으므로 고초균에서 외래유전자의 과잉 발현에 이용될 수 있을 것이다.
