Because of its peculiar mechanism for plasminogen activation and the molecular evolutionary relationship with serine protease, streptokinase had long been investigated by many researchers. But, there are little reports on the structure of streptokinase. So, to elucidate the structural and functional roles of C-terminal amino acids of streptokinase, various C-terminal deletion mutants were constructed by nested deletion of streptokinase gene with exonuclease III. After casein/human plasminogen overlay and CLN hydrolysis test, it was observed that 40 residue deletion from C-terminus did not affect the plasminogen activation efficiency. But, deletion of 46 or more amino acids had dramatically reduced the plasminogen activation efficiency. So, residue 40 to 46 from C-terminus did appear to have dramatic effect on the efficiency of plasminogen activation. It is not clear at present why the loss of 46 or more amino acids resulted in the reduction of plasminogen-activation efficiency. However, from the facts that β-turn structure generally existed in protein surface and could be interacting site with other protein, it could be proposed that the predicted β-turn structure between residue 369 to 372 was engaged in binding to plasminogen by electrostatic interaction.
Streptokinase는 혈전증 치료제로 그의 독특한 작용기작과 Serine 계열의 단백질 분해효소와의 관련성을 중심으로 오랜 기간동안 연구되어 왔다. 하지만 오랜 연구에도 불구하고 그의 구조에 대한 연구결과는 거의 없는 실정이다. 이에 최근 빠르게 발전하는 단백질 공학의 한 기법인 순차적 절단 방법에 의하여 클로닝 된 Streptokinase 유전자를 C-terminal부터 절단하는 실험을 하였다. Exonuclease III를 이용하여 순차적으로 절단한 유전자를 E. coli에 형질전환하고, 발현시켜서 생긴 Streptokinase 돌연변이체를 10가지 얻었다. 이들이 plasminogen 활성화 능력이 있는지 알아보기 위하여 Casein/plasminogen plate나 CLN을 이용하여 Plasminogen 활성화 정도를 측정하였다. 그 결과 C-terminal로부터 약 40개의 아미노산 잔기가 없어져도 plasminogen 활성화에는 영향이 없었다. 하지만 46개의 잔기가 없어지면 활성화 능력이 급격히 떨어짐을 알 수 있었다. 이와같은 사실에서 C-terminal 로부터 40에서 46번째 아미노산 잔기들이 Streptokinase 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 단백질의 이차구조를 예측한 결과에 의하면 이 부분의 아미노산 잔기들은 β-turn 구조를 이룬다는 사실이 알려졌다. 일반적으로 β-turn은 단백질의 표면에 위치하여 다른 분자들과의 결합부위에 많이 존재한다는 사실이 알려져 있다. 본 실험에서 추측된 β-turn 구조의 경우 (+) 전하를 갖는 Lysine과 Arginine이 위치하고 있어서 정전기적인 힘에 의해서 Plasminogen과 결합할 가능성이 더 커진다고 할 수 있다. 하지만 활성이 갑자기 떨어지는 이유가 Plasminogen 과의 결합이 방해받아서인지 아니면 결합능력은 있지만 Conformation 변화를 유도할 능력을 상실해서인지는 더 많은 실험적인 증거가 있어야만 해명할 수 있다.
