Nowadays, more researchers working on find out alternative of synthetic plastic because of oil exhaustion and increasing of concerning for environment. Petroleum based plastic cause serious problems to ocean, land and air by it’s hard to decomposed property. Bioplastic is one of strong candidate to replace the chemical plastics and it derived from renewable biomass sources. Biopolymers have biodegradable property in certain condition with bacteria, algae, molds and enzyme. With this powerful characteristic and carbon dioxide absorbing cycle, bioplastics can reduce the carbon dioxide emission in minus position comparing with synthetic plastic. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biomass-derived polyesters consisting of a variety of hydroxycarboxylic acids and, as polymer materials, PHAs are attractive polyesters because they are biocompatible and biodegradable plastics. However, the high production costs of PHAs are hindering their commercialization and there is a strong need to develop microorganisms that can efficiently produce PHAs from renewable carbon sources. There are a lot of attempt to improve the productivity of valuable biopolymers in bacteria in past ten years.
Poly(lactic acid), PLA, is a widely used polymer synthesized by two step process of fermentative production of lactic acid followed by its chemical polymerization via lactide. Recently, PLA and lactate-containing polymers have been produced by direct one step fermentative production by employing metabolically engineered bacteria harboring evolved propionyl-CoA transferase (Pct) from Clostridium propionicum and polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase. Since natural PhaC’s from various microorganisms have negligible activities towards D-LA-CoA, Pseudomonas sp. MBEL 6-19 PHA synthase ( $PhaC_{Ps6-19}$ ) was engineered to efficiently accept D-LA-CoA as a substrate by site directed mutagenesis. Even though the engineered $PhaC_{Ps6-19}$ could be employed for the production of D-PLA and its copolymers in Escherichia coli and Ralstonia eutropha, the polymer content achievable was rather low. It was reasoned that $PhaC_{Ps6-19}$ has rather low activity towards D-LA-CoA, and is consequently limiting D-PLA production.
Here, I report the development of engineered PHA synthases capable of more efficiently polymerizing D-lactyl-CoA through high throughput screening of a large library of PHA synthase variants by fluorescence activated cell sorting. First, I developed a FACS-based analysis technique that can quickly and accurately quantify the biopolymer produced in E. coli. Then, the randomized PHA synthase library was sorted using P (3HB) as a target product, and finally the production amount of P (3HB) was increased 4.5-fold. As a result of introducing engineered PhaC into D-PLA production, it has been doubled. Based on this engineered PHA synthase, another screening was further conducted to select candidates having the best activity for synthesizing D-PLA. An engineered E. coli strain expressing Pct and PHA synthase having V50D and F392S mutations produced D-PLA from glucose to the polymer content of 42.8 wt% of dry cell weight, which is 3.0 times higher than that expressing the control PHA synthase. Finally, I maximized the D-PLA production level by optimizing the two key enzyme expression levels. Randomized RBS libraries of each enzyme were screened using FACS in the same way. Analysis of enzyme expression levels revealed that high amounts of PhaC and low PCT expression carried the most optimal D-PLA production. As a result of applying modified RBS and engineered PHA synthase, it was possible to produce D-PLA with 52.6 wt% of dry cell weight in flask cultivation and $38.7 g l^{-1}$ in fed batch cultivation. These results are the best D-PLA production results reported so far, and they are competitive enough compared to existing commercial methods using two fermentation process. Therefore, it is expected that direct one step fermentation D-PLA using this technology will be produced in the future, and it is expected to solve problems in various modern society including environmental problems.
Poly lactic acid (PLA)는 생분해가 가능한 바이오 폴리머 중 현재 가장 널리 상용화 되어 있다. PLA는 1932년 Carothers에 의해 개발된 lactide의 Ring opening polymerization (ROP) 기술을 기반으로 한 생산공정으로 통하여 대량 생산 되고 있다. (NatureWorks) 그러나 위 방법은 공정상의 많은 분리 정제 과정에 의한 비용 증가와 환경 오염 등의 한계를 가지고 있으며, 식량으로 쓰이는 옥수수를 기반으로 한 탄소원료공급은 윤리적인 측면에서도 비판을 피할 수 없다. 이에 따라 최근에는 PLA를 박테리아 내에서 생합성하고하는 노력이 이루어졌다. 그 노력의 결과, 2010년 Jung에 의하여 대장균에 PHA 합성 효소 (PHA synthase, PhaC)와 프로피오네이트 코엔자임 트랜스퍼레이즈 (Propionate CoA-transferase, PCT)를 플라스미드 DNA를 통하여 도입함으로써 PLA 생산에 성공하였다. 생산된 PLA의 생산성은 전체 대장균 건조 중량의 10%를 넘지 못하여 상업적으로 사용하기에는 부족하였다. 낮은 PLA 생산 양을 증가시키기 위해서 대사공학적인 노력이나 발효 공정의 최적화 등의 시도가 이루어졌으나, 현재까지 생산성은 크게 늘지 못하였다. 따라서 본 연구에서는 PLA합성에 있어 가장 중요한 역할을 하는 PHA 합성 효소를 직접 진화 (direct evolution)를 통하여 개량하여 PLA 생산성을 상업적 이용이 가능한 수준까지 증대시키고자 하였다. 본 연구에서 진행한 연구들에 대하여 간략히 요약하자면 다음과 같다.
먼저 PHA 합성 효소를 개량을 가능케할 유세포분리기 (Fluorescence-activated cell sorter, FACS) 기반의 high-throughput screening (초고속 탐색) 기술을 개발하였다. (Chapter 2) 지금까지는 박테리아 내에서 생성되는 생합성고분자의 생산 양을 확인하기 위하여 박테리아를 말린 후 샘플을 만들어 기체 크로마토그래피 분석을 진행하였다. 그러나 대량의 무작위 효소 변이 체들에 의하여 생산되는 서로 다른 양의 PLA를 가지는 박테리아를 빠른 속도로 분석하고 분류하기 위해서는 높은 정확성을 가지는 초고속 탐색 기술이 필요하였다. 이를 위하여 먼저 대장균에 플라스미드DNA를 도입하여P(3HB)(Poly 3-hydroxybutyrate)를 생산하였다. 그 후 기존에 바이오폴리머를 염색 할 수 있다 알려진 Nile red와 본 연구에서 새롭게 도입된 BODIPY로 염색 한 후 유세포 분리기로 각 대장균의 형광 값을 분석 하였다. 두가지 형광 염료 중 BODIPY를 이용하였을 때 대장균 내의P(3HB) 염색에서 있어 훨씬 더 민감 하였으며 전반적으로 더 빠른 염색, 빛에 의한 형광의 적은 감소 및 높은 세포 생존력을 보였다. 또한 최적화된 분석기술로써 얻어진 형광 신호 강도는 기체 크로마토그래피로 확인 된 대장균 내의 P(3HB)의 실제 함량과 높은 상관 관계가 있음이 확인되었다. 최종적으로 이 기술을 통하여 세포 집단 내의 P(3HB) 축적의 이질성을 매우 구체적으로 모니터링 하는 것이 가능하였고, 서로 다른 양의 생합성고분자를 생산하는 박테리아를 빠르고 정확하게 분류할 수 있는 기술을 확보하였다.
다음으로 PHA 합성 효소의 활성을 증대시키기 위하여 개발된 FACS 기반의 기술을 이용하여 무작위로 구축된 효소 변이 체들의 초고속 탐색을 수행하였다. (Chapter 3)그러나 PLA를 목적으로 PHA 합성 효소를 직접적으로 탐색하기에는 현재 대장균 내에서 생산되는 PLA 생산 수준이 적기 때문에, 더 쉬운 생산이 가능하며 높은 생산 양을 보이는 P(3HB)를 목적으로 PHA 합성 효소 개량을 앞서 진행하였다. Error prone PCR에 의해 구축된 무작위의 수도모나스 sp. 유래 PHA 합성 효소 변이 체 집단에 의해 대장균내에서 서로 다른 양의 P(3HB)가 합성되었고, 이는BODIPY 염색 후 FACS를 이용하여 초고속 탐색이 수행되었다. 선별된 변이 체의 P(3HB) 생산 수준은 야생형 (wild type)에 의해 생산되는 양 (건조 세포 중량의 11.5%)보다 높은 54.2%로 증가되었다.
다음으로 대장균에서 더 많은 양의 PLA를 생산할 수 있도록 대사공학적으로 개량 된 XB15에 앞서 PHB에 높은 활성을 가지는 개량된 PHA 합성 효소를 도입하여 PLA 생산 양을 29.2%까지 증가시킬 수 있었다. 그 후, 더 높은 PLA 생산성을 확보하기 위하여 FACS 기반의 PHA 합성 효소 개량이 한번 더 수행되었다. 최종적으로 선별된 PLA synthase는 V50D 및 F392S의 변이로 건조 세포 중량의 42.8%까지 PLA 생산성을 증가시켰다. 각 변이 점의 중요성은 각 위치에 20 아미노산을 위치시키는 돌연변이 유발에 의해 확인되었다. 또한, 구조 기반의 분석에서, V50의 위치는 N-도메인 기능에 중요한 역할을 하는 돌연변이이며, F392의 위치는 촉매 도메인의 이합체 화에 영향을 미치는 돌연변이임이 확인되었다. 최종적으로 수행된 Fed-batch 발효에서 조작 된 PHA 합성 효소를 이용하였을 때, 대장균의32.6%에 해당하는 PLA를 생성 할 수 있었고 최종 생산 농도는 15.7 g /L였다.
마지막으로 PLA 생합성 경로의 최적화를 진행하여 PLA생산수준을 극대화 시키고자 하였다. (Chapter 4) 리보솜 결합 자리 (Ribosome Binding Site, RBS)를 조절하여 주요 효소의 발현 수준을 fine-tuning 진행한 결과PLA 생합성수준을 증가시켰다. 먼저, PLA의 생산에서 가장 중요한 역할을 하는 PHA 합성 효소와 PCT의 RBS 부분을 각각 11개와 8개의 무작위로 변형된 서열로 변화시킨 $10^7$ 이상의 라이브러리를 구축하였다. 그 후 FACS 기반 분류 시스템으로 초고속 탐색 되었다. 새롭게 발견 된 변형 된 리보솜 결합 자리 서열 쌍으로 PLA 생산량을 52.6%까지 증가시킬 수 있었다. 두 효소의 발현 수준과 PLA 생산 양의 상관관계를 확인하고자, 리보솜 결합 자리 서열 쌍이 조절 후의 PHA 합성 효소와 PCT의 발현 양을 측정 및 비교하였다. 그 결과, PHA 합성 효소의 발현 수준이 높을수록, PCT의 발현 수준이 낮을수록 생산량이 높음을 알 수 있었다. 마지막으로, 향상된 리보솜 결합 자리 서열 쌍과 개량된 PHA 합성 효소를 통해 fed batch 배양이 수행되었다. 60 시간 배양에서, 건조 세포 중량 47.0%의 D-PLA가 합성되었고 최종 수율 38.7g/L를 얻을 수 있었다.
전문가들은 2020년에 이르면 PLA가 건축, 자동차, 섬유, 포장 및 농업용 전자 제품뿐만 아니라 다양한 산업 분야에서 사용될 수 있을 것으로 기대하고 있다. 또한 PLA는 석유 기반의 합성 고분자와 유사한 성질을 가지기 때문에 다양한 화학 플라스틱의 가장 좋은 대안이 될 것이라 예상된다. 필자가 아는 한, 본 연구는 대장균에서 PLA를 고수준으로 생산하기 위한 PHA 합성 효소 개량의 최초보고이다. 또한 이를 통하여 fed batch cultivation에서 얻어진 38.7g/L의 생산성 역시 세계 최초의 생합성을 통한 PLA 대량생산이며 그 생산양 역시 높은 수준으로 은 실제 상업적으로 상용화 되어 있는 PLA 생산성과 비교하여도 충분히 시장 가치가 있는 양으로 예측 된다. 앞으로 실제적인 상업화를 위하여 발효 공정의 최적화와 PLA 추출 과정 단순화 등의 최적화 과정이 진행되면, 박테리아 내에서의 본격적인 생합성고분자의 대량생산이 가능할 것으로 기대한다.
