Increasing attention to well-being and healthcare has fueled the development of innovative techniques for point-of-care testing of health-related factors. For example, enormous damage and casualties that are caused by out-breaks of contagious diseases related to pathogenic bacteria, viruses, and parasites have accelerated the industrial growth in the field of microfluidics-based molecular diagnostics. Recently, a number of microfluidic devices have been developed to fulfill the existent demands, and yet most of them remain incomplete in terms of accuracy, rapidity, portability and user-friendliness. As powerful alternatives to the previous devices, this thesis presents microfluidic devices which provide automated and multiplex foodborne pathogen detection in combination with a metal indicator-mediated colorimetric detection assay on, while taking advantages of centrifugal microfluidics which does not necessitate the use of external pumps, valves and complicated detection equip-ment for operation. Furthermore, by combining the centrifugal microdevices with solution-loading cartridges, real ‘full automation’ from sample handling to result-out was successfully accomplished.
In Chapter 3, colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) using Eriochrome Black T (EBT) for molecular diagnostics of foodborne pathogens is presented. Four kinds of pathogenic bacteria (Esche-richia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium and Vibrio parahaemolyticus) were selected as targets, and LAMP primer sets were designed to specifically amplify target genes under an isothermal condition. EBT, a magnesium ion indicator, was added in the reactors to facilitate colorimetric detection of LAMP products by the naked eye. EBT reveals different colors according to the concentration of magnesium ion in solutions. As the LAMP reaction proceeded, the color of the LAMP mixture turned from purple into sky blue, which validated the feasibility of using EBT as an indicator for LAMP reactions. Four target bacteria were successfully detected by the EBT-mediated colorimetric LAMP assay.
In Chapter 4, a centrifugal LAMP microfluidic device for rapid, multiplex and colorimetric foodborne pathogen detection is presented. Five identical structures were designed in the centrifugal microfluidic system to perform the genetic analysis of 25 pathogen samples in a high-throughput manner. Sequential loading and aliquoting of LAMP cocktails, primer mixtures, and DNA sample solutions were accomplished by optimized zig-zag-shaped microchannels and RPM control. Three kinds of pathogenic bacteria (Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium and Vibrio parahaemolyticus) were targeted, and the amplicons of LAMP were detected by the EBT-mediated colorimetric method. For the limit-of-detection (LOD) test, the LAMP reaction on a chip with serially diluted DNA templates of E. coli O157:H7 was carried out, and the color change was observed with 380 copies of the target. The used primer set in the LAMP reaction was only specific to the genomic DNA of E. coli O157:H7, enabling the on-chip selective, sensitive and high-throughput pathogen identification by the naked eye. The entire process was completed in 60 min.
In Chapter 5, fully automated and colorimetric foodborne pathogen detection on an integrated cen-trifugal microfluidic device is described. All the processes for molecular diagnostics including sample pretreatment, DNA amplification and amplicon detection were integrated on a single disc. Silica microbeads incorporated in the disc enabled extraction and purification of bacterial genomic DNA from bacteria-contaminated milk samples. Four kinds of foodborne pathogens (Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Vibrio parahaemolyticus and Listeria monocytogenes) were targeted and LAMP was performed to amplify the specific genes of the targets. Colorimetric detection mediated by EBT confirmed the results of the LAMP reactions with the color change of the LAMP mixtures from purple to sky blue. The whole process was conducted in an automated manner using the lab-on-a-disc and a miniaturized rotary instrument equipped with three heating blocks. This work demonstrated that a milk sample contaminated with foodborne pathogens can be automatically ana-lyzed on the centrifugal disc even at the 10 bacterial cell level in 65 min. These advanced centrifugal microsys-tems would provide an ideal genetic analysis platform that can be used even in resource-limited environments.
In Chapter 6, a centrifugal microfluidic device was combined with solution-loading cartridges to ac-complish fully automated and user-friendly pathogen diagnostic system. Basically, this device could provide all experimental processes of molecular diagnostics including silica bead-based DNA extraction, isothermal DNA amplification by LAMP and EBT-mediated colorimetric detection. In addition, 3D-printed solution-loading car-tridges were employed to increase the sample handling capacity of the device and simplify the operation process. Since the solution-loading cartridge contains all essential components for molecular diagnostics and supplies them to the microdevice, the difficulty during the step of sample loading and injection into the device was dramatically simplified and user-friendly. We have successfully demonstrated that four kinds of foodborne pathogenic bacteria can be detected within 65 min based on the proposed microdevice, even when only $10^2$ of bacterial cells existed. This brand-new device would be a powerful tool in the field of point-of-care molecular diagnos-tics owing to total integration, automatic operation, and easy interpretation of the colorimetric results.
웰빙 그리고 헬스케어에 대한 지속적인 관심은 건강과 연결되는 여러 요인들을 현장에서 진단하는 혁신적인 기술들의 개발에 직접적인 영향을 미쳤다. 예를 들어, 최근에 바이러스, 박테리아 등에 의해 발생된 전염성 질환들로 인해 막대한 경제적 손실 및 인명 피해가 발생한 바 있는데, 이는 병원균들을 현장에서 진단할 수 있는 미세유체 기반의 분자 진단 시장의 성장에 직접적으로 기여했다. 이처럼 증대된 수요와 관심을 충족시키기 위한 다양한 종류의 현장 진단 마이크로 디바이스들이 개발되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 기존의 디바이스의 대부분은 그 정확성, 신속성, 휴대성, 편의성 등의 관점에서 성능이 매우 불완전하다. 본 연구는 기존의 디바이스들을 대체할 수 있는 한 층 뛰어난 디바이스의 개발에 초점을 맞추었다. 회전만으로 그 모든 작동이 가능한 원심 미세유체 플랫폼의 수많은 장점들을 취하면서, 현장에서 다양한 종류의 병원균들을 빠르게 검출하고 그 결과를 색 변화로 확인해주는 디바이스를 개발하였다. 나아가, 마이크로 디바이스를 용액 주입 카트리지와 결합함으로써, 샘플 처리부터 결과 출력까지의 전 과정의 진정한 자동화를 이루었다.
첫 번째로, 금속지시약인 EBT를 이용하여 병원균의 분자 진단 결과를 색 변화로 확인하는 기술을 개발하였다. 네 종류의 식중독균을 검출하기 위해 각각에 특정적인 프라이머를 제작하였으며, 등온 DNA 증폭 방법인 LAMP를 이용해 병원균의 DNA를 증폭하였다. 이때, 기존의 복잡한 검출 방법을 간단하게 하기 위해 금속지시약인 EBT를 첨가하여 색 변화로 손쉽게 검출 결과를 확인할 수 있었다. EBT는 수용액상의 마그네슘 이온 농도에 따라 다른 색을 띠게 하는 지시약이다. 한편, LAMP 반응이 일어남에 따라 앙금 생성으로 인해 반응 용액상의 마그네슘 이온 농도가 감소한다. 이 두 현상을 결합하여, EBT를 첨가함으로써 색 변화로 LAMP 반응의 결과를 확인하는 발색 검출법을 개발하였고, 네 종류의 병원체를 색 변화로 검출하였다.
두 번째로, 앞서 개발한 방법을 이용하여 다중 식중독균을 검출할 수 있는 회전식 마이크로 디바이스를 개발하였다. 분자 진단의 번거로운 작업을 간단히 하기 위해 지그재그 모양의 마이크로 채널을 적용하여 한 디바이스에서 25가지의 샘플을 동시에 검사할 수 있도록 하였다. 디바이스에 주입된 LAMP 용액, 프라이머 혼합물, 그리고 25개의 샘플은 회전에 의해 순차적으로 25개의 반응 챔버에 주입되었다. 본 디바이스를 이용해 세 종류의 식중독균 DNA를 동시에 검출하였으며, 색 변화로 그 결과가 명확히 확인되었다. 380 카피의 적은 양의 DNA 샘플의 감도 높은 검출과 선택적 검출이 가능하였으며, 검출의 전 과정은 65분 이내에 수행되었다.
세 번째로, 분자 진단의 전 과정이 통합된 마이크로 디바이스를 개발하였다. 샘플 전처리, DNA 증폭, 그리고 검출의 분자 진단의 세 과정이 한 디바이스에서 모두 수행될 수 있도록 하였다. 디바이스에 주입된 실리카 마이크로비드를 이용해 정전기적 힘에 의해 검사 샘플 안에 있는 DNA를 추출과 정제를 가능하게 했다. 그 다음 과정인 DNA 등온 증폭 반응인 LAMP 는 5개의 챔버에서 네 종류의 병원균을 검출할 수 있도록 설계하였다. 그 후의 검출 과정에는 EBT를 이용한 발색 검출을 적용하여 색 변화로 병원균 존재 여부를 손쉽게 확인 가능하도록 했다. 본 디바이스는 회전 컨트롤과 회전 장치에 포함된 가열 블록에 의해 작동되었고, 분자 진단의 전 과정이 자동적으로 수행되었다. 식중독균에 의해 감염된 우유 샘플에 대한 검사를 수행하였으며, 샘플 안에 10개의 균만이 존재하여도 검출 가능했고, 검출의 전 과정은 65분 이내에 빠르게 완료되었다.
마지막으로, 원심 미세유체 마이크로 디바이스를 용액 주입 카트리지와 결합하여 완전히 자동화되고 간편한 병원균 진단 시스템을 달성하였다. 기본적으로, 이 시스템은 마이크로비드에 의한 DNA 추출, LAMP에 의한 DNA 등온 증폭, EBT 기반의 발색 검출을 모두 수행할 수 있도록 설계되었다. 나아가 3D 프린팅 기술을 이용해 제작한 용액 주입 카트리지를 제작하여 샘플 처리 용량을 늘리고 작동 과정을 간소화했다. 용액 주입 카트리지는 분자 진단을 위한 모든 용액들을 사전에 포함하고 있다가 이를 디바이스에 전달해주는 역할을 하기 때문에 디바이스 작동에 드는 노동력을 크게 줄여 누구나 손쉽게 병원체 검출을 수행할 수 있게 하였다. 이 디바이스를 이용하여 네 종류의 식중독균을 65분 이내에 검출할 수 있었으며, 샘플에 100개의 병원균이 존재하는 상황에서도 그 검출이 가능하였다. 이러한 신개념의 디바이스는 그 단순함과 자동성으로 인해 현장 분자진단 분야에서 매우 영향력 있는 플랫폼 형성을 선도할 수 있을 것이다.
