Hyperthermphilic microorganisms has advantages for biochemical production such as reduced risk of bacterial contamination and reduced cooling requirement. Thermococcus onnurineus is a sulfur-reducing hyperthermophilic archaeon which was isolated from a deep-sea hydrothermal vent region. For biochemical production on this beneficial hyperthermophilic microbial platform, T. onnurineus was engineered using transformation with heterogeneous genes. 3-Hydroxypropionate (3-HP) and 3-Hydroxyisobutyrate (3-HIBA) were chosen as model products. For the construction of 3-HP platform, malonyl-CoA reductase (MCR) and malonate semialdehyde reductase (MSR) were introduced on the pyruvate degradation pathway of the host. T. onnurineus has several advantages as biochemical production platform. Cell mass and 3-HP could be produced simultaneously since the optimal temperatures for cell growth and related enzyme activity are close to each other and NAD(P)H, the common cofactor for both reductases, can be sufficiently generated by well-developed redox pathways. A recombinant strain for 3-HP platform was constructed successfully and $140 mg liter^{-1}$ of 3-HP was synthesized in fed-batch fermentation, Continuous fed-batch process increased 3-HP titer up to $191 mg liter^{-1}$ with a productivity was $25.3 mg liter^{-1} h^{-1}$. For the construction of 3-HIBA platform, propionate utilization pathways of the host was engineered with two heterogeneous genes of MCR and 3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase (HIBADH). By fed-batch fermentation, $2.36 mg liter^{-1}$ of 3-HIBA was synthesized. It is the first example of genetically engineered biochemical production platform based on T. onnurineus. However, further study is necessary to increase the productivity and to develop more valuable biochemical compounds.
서모코커스 온누리니우스는 파푸아뉴기니 해역의 열수구 지대에서 채취된 초고온성 고세균으로서, $80 ^\circ C$ 이상의 온도와 3-4 % (w/v) 의 염도에서 서식하는 특징이 있다. 다수의 수소생산효소 군집을 보유하고 있어, 수소 생산성이 우수하며, 그 밖에 초산, 젖산 등의 유기산과 소량의 에탄올, 2,3-부탄디올, 프로판올 등의 알코올을 만드는 것으로 알려져 있다. 서모코커스 온누리니우스와 같은 초고온성 균주는 산업용으로 사용하기에 좋은 몇 가지 장점이 있다. 대표적으로 산업용 발효 시 고온 배양에 기인하여 중온성 세균에 대한 오염의 위험이 적다. 그 외에도 온도조절에 의해 균주의 성장단계와 발효산물 생성단계를 조정하는데 용이하고, 고온의 멸균 또는 원료 전처리 후 배양을 위해 온도를 낮추는 에너지 소모가 적은 이점이 있다. 잘 발달되어 있는 산화-환원 경로도 환원이 필요한 바이오 연료 또는 산화가 필요한 유기산 제조 시 초고온성 균주 사용의 가치를 높인다.
그럼에도 불구하고, 고온성 또는 초고온성 균주를 이용한 바이오 케미컬 기술에 대한 연구는 아직 초기 단계이다. 서모언에어로박터 매스라니와 칼디셀룰로시럽터 베시아이 변이주를 이용하여 에탄올을 생산한 보고가 있고, 파이로코커스 퓨리오서스를 형질전환하여 젖산, 에탄올, 부탄올 그리고 3-하이드로프로피온산을 생산한 연구 사례가 있다. 이에 본 연구를 통해서 서모코커스 온누리니우스 균주를 이용하여 선행연구와 같이 바이오 케미컬을 제조할 수 있는 플랫폼으로서의 가능성을 확인하고자 하였다. 확인을 위한 모델 대사산물은 3-하이드록시프로피온산과 3-하이드록시이소부틸산으로 정하였다. 서모코커스 온누리니우스 균주에서 3-하이드록시프로피온산을 제조하기 위해 메탈로스파에라 세듈라 균주로부터 말로닐 조효소A 환원효소와 말로네이트세미알데하이드 환원효소 유전자를 도입하였다. 모균주는 전분 또는 맥아당을 세포 내로 받아들여 아세틸 조효소A로 대사하고 대부분은 초산으로 전환되면서 에너지를 생성하는데 사용된다. 상기 두 유전자를 도입함으로써, 모균주가 발현하는 아세틸 조효소A 카르복실화 효소에 의해 생성된 말로닐 조효소A가 말로닐 조효소A 환원효소에 의해 말로네이트 세미알데하이드로 이는 다시 말로네이트 세미알데하이드 환원효소에 의해 3-하이드록시프로피온산으로 전환될 수 있다.
서모코커스 온누리니우스의 형질 전환을 위해, 갈락토오스 탈수소화효소 프로모터와 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소A 환원효소 유전자가 포함되어 있는 고온성 고세균용 벡터를 사용하였다. 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소A 환원효소는 형질 전환된 균주가 심바스타틴 존재 하에서도 성장할 수 있도록 하여 선별이 가능하게 한다. 벡터에는 도입된 유전자가 삽입될 위치의 지놈 디엔에이와 같은 디엔에이 서열이 도입 유전자 양쪽에 배치되어 있어 상동재조합을 유도한다. 형질전환 후, 형질전환 균주로부터 메신저 알엔에이를 추출하여 역전사 피씨알을 수행함으로써 도입된 유전자의 전사가 이루어지고 있음을 확인하였다. 또한 발현된 단백질에 도입된 유전자의 기질을 넣어, 보조인자가 소모되는 것을 통해 도입된 단백질의 활성을 확인하였다.
형질전환 균주를 $70 ^\circ C$ 에서 배양한 결과 성장에 큰 영향이 없는 것으로 판단되었다. 이는, 본 연구에서 참고한 선행연구에서 3-하이드록시프로피온산 생산에 사용된 파이로코커스 퓨리오서스의 경우와는 다르게, 배양을 하면서 동시에 3-하이드록시프로피온산을 생산 할 수 있다는 장점이 있다. 생장단계와 생산단계의 온도를 구분할 필요가 없어 생산성을 증가 시키는 의의가 있다. 형질전환 균주의 유가식 배양을 수행한 결과, $140 mg liter^{-1}$ 농도의 3-하이드록시프로피온산을 생산하였다. 소량의 기질을 연속적으로 주입하는 유가식 배양을 통해 3-하이드록시프로피온산 농도를 $191 mg liter^{-1}$ 로 증가시켰다. 이 때 생산성은 $25.3 mg liter^{-1} h^{-1}$ 이었다.
한편, 서모코커스 온누리니우스에서 3-하이드록시이소부틸산을 생산하기 위해서는 메틸 말로닐 조효소A 환원효소와 3-하이드록시이소부틸산 탈수소효소 도입이 필요하였다. 하지만 메틸 말로닐 조효소A 환원효소는 자연적으로 존재하지 않는 효소이므로, 메틸 말로닐 조효소A의 환원능이 있는 말로닐 조효소A 환원효소를 도입하였고, 3-하이드록시이소부틸산 탈수소효소는 메탈로스파에라 세듈라 균주의 유전자 서열을 참고하여 합성한 뒤 도입되었다.
서모코커스 온누리니우스가 질소원을 분해할 때, 생성되는 프로피오닐 조효소A는 메틸 말로닐 조효소A로 전환되고 다시 메틸 말로닐 조효소A 뮤테이즈에 의해 숙시닐 조효소A로 전환되어 소모된다. 상기 두 효소의 도입으로 메틸 말로닐 조효소A는 메틸 말로네이트 세미알데하이즈로 전환되고 이를 다시 3-하이드록시이소부틸산으로 전환된다. 이때, 숙시닐 조효소A로 전환되는 경로와 경쟁하지 못하도록 도입유전자를 메틸 말로닐 조효소A 뮤테이즈 유전자 중간에 삽입하여 메틸 말로닐 조효소A 뮤테이즈의 정상적인 발현을 저해하였다. 형질전환 방법 및 전사, 효소 활성 평가는 3-하이드록시프로피온산 생산을 위한 형질전환과 동일한 방법으로 수행하였다. 형질전환 균주의 유가식 발효 결과, $2.36 mg liter^{-1}$ 의 3-하이드록시이소부틸산이 생성되었다.
본 연구를 통해 서모코커스 온누리니우스를 이용한 모델 산물의 생산 기반을 구축하였지만, 수율과 생산성이 낮아 이를 해결하기 위한 연구가 이루어져야 한다. 또한, 초고열성 균주 기반에 특화된 새로운 바이오케미컬에 대한 탐색이 필요하다.
