Protein-protein interactions (PPIs) are biological processes for cell metabolism, membrane transport, and signal transduction. Based on the fundamental roles in the cell, the importance of protein interactions has been increasing in studies of both basic researches and human diseases. To date, many methods to analyze specific protein interactions have been used through conventional antibodies and natural protein binders. In this regard, we developed new protein binders for analyzing and tracking protein-protein interactions.
In chapter 1, we used a non-antibody scaffold to detect and quantify human tumor necrosis factor-alpha (hTNF- $alpha$) for immunoassays. We selected specific binder through phage display and modular engineering. Selected binder was genetically fused to monomeric alkaline phosphatase (mAP), and the resulting mAP fusion protein was used for direct and sandwich immunoassays of hTNF- $alpha$. mAP fusion protein exhibited high sensitivity and accuracy in a direct and sandwich immunoassays. Furthermore, a monomeric AP was more suitable as a signal generator than a dimeric AP in an immunoassay.
Chapter 2 describes development of a novel protein binder to detect and analyze human Rac1 (Ras-related small GTPase). We selected a novel Rac1 binder with a high binding affinity and specificity, and selected binders exhibited a higher selectivity to active Rac1 than inactive Rac1. A selected binder completely inhibited effector protein binding to active Rac1, which indicates potential utility in cancer therapy. Through cell-based assay, we confirmed that selected binder can effectively detect endogenous Rac1 using protein delivery system and analyze cell movement using expression of Rac1 binder in mammalian cells.
In this study, we demonstrated the utility and potential of a non-antibody scaffold by showing development of hTNF-$alpha$ for immunoassays and analysis of human Rac1. These results indicate that target specific binders can be widely used in methods for detection and analysis of protein-protein interactions while alternating conventional antibodies and natural protein binders.
단백질-단백질 상호작용은 세포의 대사작용, 물질 수송 및 신호 전달을 위한 생물학적 과정이다. 세포에서 필수적인 역할을 함으로써, 단백질 상호작용은 생물의 기초연구 및 인간 질병 연구에서 중요성이 커지고 있다. 현재까지 많은 종류의 항체와 천연 단백질 결합체를 이용한 단백질 상호작용 분석법이 이용되고 있다. 이에, 본 연구에서는 단백질-단백질 상호작용을 분석하고 추적하는 새로운 단백질 결합체 개발에 관한 연구를 수행하였다.
1장에서는 인간종양괴사인자의 검출 및 정량화를 위한 면역분석법에 인공항체를 이용하였다. 파지디스플레이 및 모듈 기반의 단백질 설계를 통해서 인간종양괴사인자에 특이적으로 결합하는 결합체를 선별하였고, 단 합체 알칼리인산분해효소와의 융합을 통해서 직접적면역분석법 및 샌드위치면역분석법에 적용하였다. 그 결과 비 항체 융합단백질은 면역분석법에서 인간종양괴사인자에 대한 높은 민감도와 정확성을 나타냈다. 또한 기존에 널리 쓰이는 이 합체 알칼리인산분해효소와 비교를 통해서 단 합체 알칼리인산분해효소가 기질의 신호 발생에 더 적합하다는 것을 확인하였다.
2장에서는 인간 Rac1 단백질의 검출 및 분석을 위해서 새로운 단백질 결합체를 개발하였다. 개발된 단백질 결합체는 인간 Rac1 단백질에 대해서 높은 결합력과 특이성을 보였으며, 무엇보다 비활성 인간 Rac1 단백질보다 활성 인간 Rac1 단백질에 더 높은 선택성을 나타냈다. 선별된 결합체는 이펙터 단백질의 인간 Rac1 단백질에 대한 결합을 완전히 억제하므로서 암 치료제로의 이용 가능성도 나타냈다. 또한 세포 기반 분석법을 이용하여 선별된 단백질 결합체를 세포 내 전달 시스템을 통해서 동물세포 내로 도입한 결과 세포 내에 존재하는 인간 Rac1 단백질을 효과적으로 검출할 수 있었으며, 동물세포 내에서의 직접적인 단백질 결합체 발현을 통해서 개발된 단백질 결합체가 세포의 운동성을 분석할 수 있는 새로운 방법으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
이상의 연구에서, 인간종양괴사인자 면역분석법과 인간 Rac1 단백질 검출 및 분석을 통해서 인공항체의 유용성과 그 가능성을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 인공항체는 기존에 널리 쓰이고 있는 항체와 천연 단백질 결합체를 대체하면서 단백질-단백질 상호작용의 검출과 분석을 위한 분석방법으로 널리 이용될 것으로 기대된다.
