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Studies on enhancing therapeutic protein production and quality in recombinant CHO cells = 재조합 CHO 세포로부터 생산된 치료용 단백질의 생산성 향상 및 품질 강화 연구
서명 / 저자 Studies on enhancing therapeutic protein production and quality in recombinant CHO cells = 재조합 CHO 세포로부터 생산된 치료용 단백질의 생산성 향상 및 품질 강화 연구 / Jin-Hyoung Park.
저자명 Park, Jin-Hyoung ; 박진형
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2017].
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Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most widely used host cell lines for the production of therapeutic proteins because of the ability of human like glycosylated protein production. Considering productivity and quality is most important to produce therapeutic proteins by recombinant CHO (rCHO) cell culture. Addition of sodium butyrate (NaBu) or lithium chloride (LiCl) incuced cell cycle arrest with a concurrent increase in the specific productivity for a number of therapeutic proteins. However, these chemical reagents are also cytotoxic and induce apoptotic cell death, and may negatively affect the quality of glycoproteins produced in CHO cells. Dex-tran sulfate (DS) is probably the most widely applied anti-aggregation agent in suspension cultures of CHO cells. However, the effet of different molecular weights (MWs) and concentration of DS on the cell growth, protein productivity, and quality attributes of rCHO cells has not been fully substantiated yet. Glycosylation structure is the most critical factor to determine the product quality of therapeutic proteins. However, some proteases and glycosidases that accumulated in culture supernatant negatively affect the quality of therapeutic proteins in rCHO cell cultures. Recently, identification and quantification of intracellular and extracellular proteome were performed using mass spectrometry based on omics technology. In this study, to find a less harmful and more effective chemical reagent, eight chemical reagents were evaluated for cell cycle arrest, producitivity, and quality of monoclonal antibody (mAb). And to examine the effect of DS on cell growth and mAb production of rCHO cells, three different MWs of DS at various concentrations were evaluated in two different rCHO cell lines producing mAb. Finally, in an effort to maintain good quality of mAb and Fc-fusion protein during the cultures, host cell proteins (HCPs) accumulated culture medium were characterized based on omics study. To find a more effective chemical reagent for improved monoclonal antibody (mAb) production, eight chemical reagents (curcumin, quercein, DL-sulforaphane, thymidine, valeric acid, phenyl butyrate, valproic acid, and lithium chloride) known to induce cell cycle arrest were examined individually as chemical additives to re-combinant CHO (rCHO) cell cultures producing mAb. Among these chemical additives, valeric acid showed the best production performance. Valeric acid decreased specific growth rate ($\mu$), but increased culture longevity and specific mAb productivity ($q_mAb$ in a dose-dependent manner. The beneficial effect of valeric acid on culture longevity and $q_mAb$ outweighed its detrimental effect on $\mu$, resulting in 2.9-fold increase in the maximum mAb concentration when 1.5 mM valeric acid was added to the cultures. Furthermore, valeric acid did not negatively affect the mAb quality attributes with regard to aggregation, charge variation, and galacto-sylation. Unexpectedly, galactosylation of the mAb increased by the addition of 1.5 mM valeric acid. Taken together, the results obtained here demonstrate that valeric acid is an effective chemical reagent to increase mAb production in rCHO cells. To investigate the effect of dextran sulfate (DS), a widely used anti-aggregation agent, on cell growth and monoclonal antibody (mAb) production including the quality attributes, DS with the three different MWs (4,000 Da, 15,000 Da, and 40,000 Da) at various concentrations (up to 1 g/L) was added to suspension cultures of two different recombinant CHO (rCHO) cell lines producing mAb, SM-0.025 and CS13-1.00. For both cell lines, the addition of DS, regardless of the MW and concentration of DS used, improved cell growth and viabil-ity in the decline phase of growth. However, it increased mAb production only in the CS13- 1.00 cells. Among the three different MWs, 40,000 Da DS was most effective in attenuating cell aggregation during the cultures of CS13-1.00 cells, and showed the highest maximum mAb concentration. For SM-0.025 cells, it significantly de-creased specific mAb productivity, particularly at a high concentration of DS. Overall, DS addition did not neg-atively affect the quality attributes of mAbs (aggregation, charge variation, and glycosylation), though its effi-cacy on mAb quality depended on the MW and concentration of DS and cell lines. For both cell lines, the addi-tion of DS did not affect N-glycosylation of mAbs and decreased basic charge variants in mAbs. For CS13-1.00 cells, the mAb monomer increased with the addition of 40,000 Da DS at 0.3?1.0 g/L. Taken together, to maxim-ize the beneficial effect of DS addition on mAb production, the optimal MW and concentration of DS should be determined for each specific rCHO cell line. Host cell proteins (HCPs), secreted and released from lysed cells, accumulate extracellularly during the cultures of recombinant CHO (rCHO) cells, potentially impairing product quality. In an effort to maintain good quality of mAb and Fc-fusion proteins during the cultures, HCPs accumulated extracellularly in batch and fed-batch cultures of a mAb producing rCHO cell line (SM-0.025) and Fc-fusion protein producing rCHO cell lines (DG-Fc and DUKX-Fc) were identified and quantified by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spec-trometry, followed by their gene ontology and functional analysis. Clustering analysis of HCPs, classified into four clusters according to their concentration profiles during the cultures, showed that the concentration profiles of HCPs affecting mAb quality (Lgmn, Ctsd, Gbl1, Neu1, and B4galt1) correlated with changes in quality at-tributes such as aggregation, charge variants, and N-glycosylation during the cultures. Taken together, the da-taset of HCPs obtained in this study provides insights into determining the appropriate target proteins to be re-moved during both the cultures and purification steps for ensuring good mAb quality.

Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 생산된 단백질의 당쇄화 구조가 인간 유래의 것과 유사한 장점이 있어 치료용 단백질을 생산하는데 있어 가장 널리 사용되는 숙주 세포주이다. CHO 세포 배양으로부터 치료용 단백질을 생산하는데 있어 생산성과 품질을 고려해야 할 중요한 사항이다. 생산성 향상을 위해 뷰티르산 염이나 염화 리튬을 세포배양 배지에 첨가하는 것은 생산성을 향상 하지만, apoptotic 세포사를 유발하거나 치료용 단백질의 품질을 저해한다. 또한, 고농도 세포배양이나 세포사멸기간에 발생하는 세포응집 현상을 막기위해 첨가하는 덱스트란황산의 특성화 연구 역시 부족한 상황이다. 당쇄화 구조는 치료용 단백질의 품질을 결정하는 가장 중요한 요소이며, 배양배지내에 있는 다양한 종류의 프로테아제와 글리코시다아제 들에 의해 분해되기도 한다. 고품질의 치료용 단백질 생산을 목적으로, 단백질체학을 기반으로 하는 오믹스 접근법을 통하여 세포배양배지에 포함된 단백질체를 정성적 및 정량적 분석하려는 노력들이 시도되고 있다. 따라서 본 연구에서는 치료용 단백질의 생산성 및 품질을 모두 향상 시킬 수 있는 새로운 배지 첨가물질을 발굴하기 위한 연구를 하였고, 덱스트란황산의 분자량과 첨가 농도에 따른 세포배양 결과를 통한 특성화 연구를 하였다. 마지막으로, 제품 품질의 향상을 위한 새로운 타겟 단백질을 찾기 위해 세포 배양액 속에 포함된 host cell protein (HCP)을 분석하고나 mass spectrome-try (MS) 기기와 생물정보학 기술을 기반으로 한 프로티오믹스 연구를 수행하였다. 먼저 새로운 배지 첨가물질을 발굴하기 위해 세포의 성장을 저해시킨다고 알려진 8종류의 첨가물 실험을 하였고, 그 결과 세포성장은 저해시키지만 생산성을 3배이상 향상 시키는 발레르 산을 발굴하였다. 발레르 산은 histone deacetylase 1(HDAC1)의 활성을 저해 시킴으로써 cell cycle중에서 G1 phase를 억제한다고 알려져 있다. 생산성을 최대로 증가 시키는 발레르 산의 농도는 1.5mM 이었으며, 이는 단일클론 항체를 생산하는 두 종류의 생산 세포주에서 같은 결과를 보였다. 이 조건을 바탕으로 bioreactor scale에서 재현해 보았을 때, 결과는 flask scale과 비슷한 결과를 보였다. 또한, bioreactor scale에서 생산된 단일클론 항체의 품질 분석을 수행하였을 때, 품질의 저해는 보이지 않았고 오히려 galacto-sylation이 향상되는 것을 볼 수 있었다. 이는 세포성장 저해로 인해 배지내 글루코스가 배양 후반부까지 남아있어서 당쇄화의 재료로 사용될 수 있었기 때문이라고 생각한다. 발레르 산은 CHO 세포 배양에서 품질의 저해 없이 생산성을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 새로운 물질임을 확인하였다. 다음은 CHO 세포 배양에서 세포응집현상을 막기 위해 첨가하는 덱스트란황산의 분자량과 첨가농도가 세포성장, 생산성, 단일클론 항체의 품질에 어떤 영향을 주는지에 대한 연구이다. 이를 위해 단일클론 항체를 생산하는 두 종류의 세포주 (SM-0.025 와 CS13-1.00)의 배양 실험에 다양한 분자량 (4,000Da - 40,000Da)과 농도 (0.1g/L-1.0g/L)의 덱스트란황산을 첨가하였다. 덱스트란황산의 첨가는 세포응집을 저해하였고, 세포배양기간을 하루씩 증가시켰다. 하지만, 생산성의 향상은 첨가한 덱스트란황산의 분자량과 농도에따라 다른 것을 확인하였다. 단일클론 항체의 품질분석 결과, 항체의 응집을 저해하고 염기성 전하변이체를 줄이는 효과를 보였다. 반면에 단일클론 항체의 당쇄화에는 큰 영향을 주지 않았다. 결국 재조합 CHO 세포배양에서 생산성과 품질을 증가시키기 위하여 사용되는 덱스트란황산은 세포주의 특성과 목적 단백질의 특성에 따라 적절한 분자량과 첨가 농도실험을 통해 최적의 조건을 선정한 후에 사용해야 한다. 세번째로 치료용 단백질의 품질 향상을 위한 타겟 발굴을 위해 CHO 세포 배양액에 포함되어 있는 단백질을 분석하고자 단일클론 항체와 Fc-융합단백질을 생산하는 서로 다른 세 종류 (SM-0.025, DG-Fc, DUKX-Fc)의 세포주를 이용하여 회분식 배양과 유가식 배양을 수행하였다. 배양배지 내에 포함된 HCP를 분석하기 위해 생산하고자 하는 목적 단백질을 protein A resin을 이용하여 제거하고, MS 기기에 적합한 샘플을 만들기 위한 전처리 과정을 거친 후, nanoflow HPLC-Tandem MS (LC-MS/MS) 기기를 이용하여 HCP를 분석하였다. 세포주마다 서로다른 HCP 프로파일을 보였고, 정성적 및 정량적으로 분석된 HCP의 개수와 종류 역시 다른 것을 확인하였다. 제품의 품질을 저해하는 프로테아제인cathepsin D (Ctsd), legumain (Lgmn)등을 발견할 수 있었고, 당쇄화에 영향을 주는 beta-galactosidase (Glb1), sialidase 1(Neu1), beta-1,4-galactosyltransferase (B4galt1)등을 발견할 수 있었다. 앞으로 발견한 타겟 단백질의 유전자 엔지니어링을 통한 치료용 단백질의 품질 유지 및 향상을 확인이 필요하다고 생각한다. 결론적으로, 발레르 산의 첨가를 통해 치료용 단백질의 생산성을 증가 시킬 수 있고, 고농도 배양이나 세포사멸기간에 발생하는 세포 응집의 해결을 위한 덱스트란황산의 최적화를 통해 추가적인 생산성의 증가와 품질의 향상을 얻을 수 있다. 또한, 제품 품질의 향상을 위해 발굴된 새로운 타겟 단백질의 유전자 엔지니어링을 통해 고품질 의약품의 고생산을 얻을 수 있다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 17011
형태사항 xvii, 141 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 박진형
지도교수의 영문표기 : Gyun Min Lee
지도교수의 한글표기 : 이균민
수록잡지명 : "The Molecular Weight and Concentration of Dextran Sulfate Affect Cell Growth and Antibody Production in CHO Cell Cultures". Biotechnology Progress, v. 32. no. 5, pp. 1113-1122(2016)
수록잡지명 : "Valeric Acid Induces Cell Cycle Arrest at G1 phase in CHO Cell Cultures and Improves Recombinant Antibody Productivity". Biotechnology Journal, v. 11. no. 4, pp. 487-496(2016)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 References : p. 121-136
주제 Recombinant CHO cell
monocloanl antibody
Fc-fusion protein
Valeric acid
Dextran sulfate
Proteomics
Host cell protein
재조합 CHO세포
단일클론 항체
Fc-융합 단백질
발레르 산
덱스트란 황산
프로티오믹스
숙주세포단백질
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