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Enhanced sialylation of recombinant EPO produced in CHO cells by modulating biosynthesis pathway of sialylation = 시알산 생합성 경로 조절을 통한 CHO 세포 재조합 Erythropoietin 의 시알산 함량 증진
서명 / 저자 Enhanced sialylation of recombinant EPO produced in CHO cells by modulating biosynthesis pathway of sialylation = 시알산 생합성 경로 조절을 통한 CHO 세포 재조합 Erythropoietin 의 시알산 함량 증진 / Chan Yeong Kwak.
저자명 Kwak, Chan Yeong ; 곽찬영
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2017].
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Sialylation of recombinant therapeutic glycoproteins modulates in vivo half-life associated with therapeutic efficacy. CMP-Neu5Ac, a precursor of sialylation pathway, has known as a limiting factor that increases sialylation of glycoproteins. Here, we initially found that sialylation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) was increased by treatment with a potent inhibitor of GSL biosynthesis. The GSL expression level of cells treated with EtDO-P4 was dramatically decreased, while sialic acid content of rhEPO in culture media was significantly increased. We noted that the supplementation of a chemical inhibitor in a large-scale culture is subject to a number of issues including cost and side effect. Thus, we established genetically modified EC2-1H9 CHO cell, which produces the rhEPO having enhanced sialylation by inhibition of GSL synthesis. Ahead of stable CHO cell line construction, we designed small interference RNA targeting Cricetulus griseus UGCG mRNA. These target sequences show no significant homology with any other genes in the genome of mouse, rat and human. In case of EC2-1H9 cells treated with siRNA, the expression level of UGCG and GSLs were significantly decreased, while sialylation of rhEPO in culture media was significantly increased to 50%. These results indicate that the sialylation of glycoproteins is higly related to GSL, and the inhibition of GSL promotes enhanced sialylation of glycoproteins. Furthermore, we established stable CHO cells producing rhEPO under the inhibition of UDP-glucose ceramide glucosyltransferase (UGCG) gene encoding the key enzyme in the initiation of GSL biosynthesis. The expression of gangliosides was inhibited in UGCG repressed cells, whereas sialylation of rhEPO was significantly increased. In addition, a detailed analysis of N-glycosylation showed that di-sialylated N-glycan of rhEPO produced in EC2-1H9-miUGCG1 cells increases by 10.2%, whereas neutral and mono-sialylated N-glycan was reduced compared to rhEPO produced in EC2-1H9 cells. However, we did not observe any change in the sialylation of tri- and tetra-sialylated N-glycans of rhEPO. We found that intracellular CMP-Neu5Ac accumulated by inhibition of GSL biosynthesis, was rapidly consumed in the sialylation of rhEPO inducing dynamic equilibrium. Thus, we were attempted to increase of CMP-Neu5Ac concentration in Golgi by simultaneous overexpression of GNE and CSAT. While the intracellular CMP-Neu5Ac content in EC2-1H9-rCU3 cells was increased about 5.6-fold, the final sialylation was only increased by 44.6% compared to EC2-1H9 control cells. The sialylation of EC2-1H9-rCU3 cells was slightly increased to 9.0% compared to EC2-1H9-miUGCG1 cells, which were induced by inhibition of GSL biosynthesis. In comparison to EC2-1H9-rEKm9 cells, which were overexpressed GNE, CSAT and ST, the sialylation of EC2-1H9-rCU3 cells was only increased to 4.4%.

재조합 당단백질의약품 당사슬 말단의 시알산은 치료 효능과 관련된 생체 내 반감기에 큰 영향을 미친다고 알려져 있으며, 시알산의 전구체인 CMP-Neu5Ac는 당 단백질의 시알릴화 경로에서 중요한 제한요인 (limiting factor) 으로 알려져 있다. 이 연구에서 우리는 당지질 (GSL) 생합성을 강력한 억제제로 처리함으로써 재조합 인간 에리스로포이에틴 (rhEPO)의 시알릴화가 증가됨을 발견하였다. EtDO-P4로 처리 된 세포의 당지질 수준은 현저하게 감소하였으며 배양 배지의 rhEPO의 시알릴화는 유의하게 증가하였다. 한편, 대규모 배양공정에서 화학 억제제를 첨가하는 것은 비용과 부작용을 포함하는 많은 문제점을 가지고 있다. 따라서 유전공학적인 방법을 통하여 당지질 합성이 지속적으로 억제된 CHO 세포를 구축하고 시알릴화가 증가된 rhEPO를 생산 하고자 하였다. 안정된 CHO 세포주 구축에 앞서 우리는 당지질 생합성 초기 단계에 작용하는 세라마이드 글루코실 트랜스퍼레이즈 (CGT) 를 암호화하는 UDP-글루코스 세라마이드 글루코실 트랜스퍼레이즈 (UGCG) 유전자를 표적으로 하여 siRNA를 설계하였다. siRNA 표적 서열은 마우스, 래트 및 인간 게놈의 다른 모든 유전자와 유의한 상동성을 나타내지 않았다. siRNA를 처리한 EC2-1H9 CHO 세포의 경우 UGCG 및 당지질의 발현 수준이 유의하게 감소하였으며, 생산된 rhEPO의 시알릴화는 50 % 가까이 유의하게 증가 하였다. 이러한 결과는 당지질 생합성이 당단백질의 시알릴화와 밀접한 관련이 있으며, 당지질 합성 저해가 당단백질의 시알릴화를 증진시킨다는 것을 나타낸다. 또한, siRNA 서열을 바탕으로 UGCG 유전자가 지속적으로 억제된 CHO 세포주를 구축하고 생산된 rhEPO의 당사슬 변화를 분석하였다. UGCG 억제 CHO 세포주 (EC2-1H9-miUGCG cell line) 에서 주요 당지질인 갱글리오사이드의 발현은 억제되었고 생산된 rhEPO의 시알릴화는 유의하게 증가하였다. 또한, HPLC를 이용한 N-당사슬에 대한 분석 결과 EC2-1H9-miUGCG1 세포에서 생산된 rhEPO의 di-시알릴화 N-당사슬은 10.2 % 증가하는 반면 neutral 및 mono-시알릴화 N-당사슬은 대조군 세포에서 생성된 rhEPO와 비교하여 현저하게 감소함을 보였다. 그러나, rhEPO의 tri- 및 tetra-시알릴화 N-당사슬은 실험군과 대조군 사이에 큰 변화를 보이지 않았다. 또한, 흥미롭게도 세포 내부 및 골지 내부의 CMP-Neu5Ac 함량은 실험군과 대조군 사이에 큰 변화를 보이지 않았다. 이러한 결과는 당지질 생합성의 억제에 의해 축적된 세포 내 CMP-Neu5Ac가 동적 평형을 통하여 rhEPO의 시알릴화에 빠르게 소모된다는 것을 나타낸다. 우리는 구축한 EC2-1H9-miUGCG1 세포주에 GNE와 CSAT를 동시에 과발현 함으로써 골지 내부의 CMP-Neu5Ac 농도를 증가시키고자 시도하였다. 구축된 EC2-1H9-rCU3 세포의 세포 내 CMP-Neu5Ac 함량은 약 5.6 배 증가되었지만, 최종 시알산 함량은 EC2-1H9 대조군 세포와 비교하여 44.6 % 증가했다. EC2-1H9-rCU3 세포의 시알산 함량은 EC2-1H9-miUGCG1 세포와 비교하여 9.0 %로 약간 증가 하였다. 그러나 GNE, CSAT 및 ST를 과발현시킨 EC2-1H9-rEKm9 세포와 비교하여, EC2-1H9-rCU3 세포의 시알산 함량은 단지 4.4 % 증가되었다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 17004
형태사항 vii, 94 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 곽찬영
지도교수의 영문표기 : Jung Hoe Kim
지도교수의 한글표기 : 김정회
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 References : p. 85-90
주제 CHO
CMP-Neu5Ac
Erythropoietin
Glycosphingolipid
Sialylation
UGCG
중국햄스터난소세포
에리스로포이어틴
당지질
시알산
UGCG
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