Oral gavage is known as one of most convenient routes for therapeutic administration in compared with other available routes such as intravenous, intra muscular, suppository etc. Oral vaccine delivery system has additional potential as it may provide a convenient way to prevent infectious diseases by introducing optimum immunization in mucus. Although oral vaccine delivery has attracted tremendous interests in vaccine delivery research but various limitations have prevented its rate of progress up to the level as was expected. However, the major problem of oral vaccine delivery is its instability and lack of absorbability resulted from degradation of the sophisticated antigens in acidic medium in stomach. In order to obtain adequate microfold-cell (M-cell) targeting and uptake, the therapeutics is required to pass through stomach and reach to small intestine without degradation. In this project, we have introduced a conjugate of $beta$ - glucan and glycine-arginine-glycine-aspartic acid-serine (GRGDS) that is effective for simultaneous protection of the antigen (PR8) and M-cell targeting efficacy. According to the experimental results, the cationic $beta$ - glucan-GRGDS conjugate can encapsulate a certain amount of anionic PR8 through electrostatic interaction that forms nanoparticles with a range of 200-250nm in diameter. Also, the PR8 incorporated nanoparticles showed high cell viabilities and stabilities in diverse environments. Finally, excellent M-cell targeting abilities were verified in an $in vitro$ M-cell model that shows excellent targeting efficiency. Most importantly the $in vivo$ test obviously demonstrate superiority of this system as it significantly increases antibody concentration in serum, intestine and mucus measured after 21 days of immunization.
현재 대부분의 백신은 주사기에 의해 전달이 이루어지고 있다. 하지만 이러한 백신전달은 고통과
불편함을 수반하며 감염위험이 있어 대체방법에 관한 연구가 진행되고 있다. 대체방법중
경구투여에 의한 백신전달이 가장 각광받고 있는 영역이며 경구투여에 의한 백신전달은 간편하고
쉽게 면역반응을 유도해낼 수 있다는 장점이 있다. 또한, 점막면역까지 유도해내어 주사기에 의한
백신전달보다 한층 더 효과적으로 외부 바이러스로부터 신체를 안전하게 보호할 수 있다는
장점이 있다. 경구투여는 이러한 장점을 가지고 있지만 위산과 효소에 의한 분해, 소장내로
원활한 흡수가 진행되지 못한다는 단점을 가지고 있다. 본 연구에서는 이러한 단점을 극복하여
효과적으로 면역반응을 유도해낼 수 있는 나노입자 시스템을 구축하였다. 이 연구에서는
베타글루칸이라는 물질이 나노입자로서 사용되었는데, 이 베타글루칸은 안정성이 뛰어나며
곡류나 버섯류로부터 추출되어 생체에 적합하다. 하지만 베타글루칸만으로는 소장내로
효과적으로 흡수될 수 없어, M-cell을 타겟팅할 수 있는 물질인 GRGDS를 베타글루칸에
결합하였다. 원소분석과 FT-IR에 의해 합성이 성공적으로 이루어졌음을 입증하였으며, 항원과
베타글루칸의 정전기적 인력에 의해 나노입자를 형성하였다. 입자크기는 대략 250nm로
확인되었으며, 제타포텐셜을 측정한 결과 -13.4mV의 값이 확인되었다. M-cell을 경유하기 위해
300nm 이하의 크기를 가져야 하며, 소장을 덮고 있는 점막은 음전하를 띄고 있기 때문에 위의
결과로 인해 소장내로 흡수가 잘 일어날 수 있을것이라고 예측할 수 있다. 다음으로, pH와 FaSSIF
용액에 의해 안정성을 확인해 보았다. 확인결과, pH 변화에 따라 나노입자 크기의 변화가
없었으며, FaSSIF에서도 마찬가지로 입자크기의 큰 변화를 보이지 않았다. 이 두 결과에 의해 이
나노입자는 위와 장내에서 안정하게 나노입자 형태를 유지할 수 있음을 보였다. 다음으로 세포
독성 실험을 진행하였다. Caco-2 cell은 구조적으로, 기능적으로 장세포와 닮았기 때문에 이 세포를
이용하여 독성테스트를 해본결과, 어떠한 독성도 발견되지 않았다. 또한, in vitro M-cell 전달
실험을 진행하였다. Caco-2cell과 비교해본 결과, M-cell의 존재하에서 훨씬 높은 전달수치를
보여주었다. 이 결과에 의해 성공적으로 M-cell을 타겟팅할 수 있음을 입증하였다. 또한,
biodistribution 결과에 의해서도 나노입자가 소장내로 흡수가 많이 진행되었음이 입증되었다.
마지막으로 이 나노입자에 의해 유도된 항체량을 측정해보았다. 소장과 점막, 혈청에 의해
항체량을 측정해 보았으며 ,측정결과 GRGDS가 결합된 나노입자 시스템에서 월등히 높은
항체반응을 보여주었다. 또한, 유도된 항체량을 비교해보면 IgA보다 IgG가 대략 5배정도 높은
수치가 나왔음을 볼 수 있는데 그 이유로는 소장으로 흡수되어 간으로 전달된 나노입자 양이
많기 때문이라고 추측할 수 있다. 결론적으로, 이 나노입은 위와 장 내에서 안정하게 나노입자
형태를 유지할 수 있으며, M-cell을 경유하여 효과적으로 소장내로 흡수되었음을 볼 수 있다. 이
과정에 의해 IgA뿐만 아니라 IgG항체도 유도하여 외부 바이러스의 침투를 효율적으로 예방할 수
있었다. 이러한 시스템을 이용한다면, 이 연구에서 사용한 Pr8 influenza 이외에 다른 경구백신을
이용하여도 높은 효능을 보일 수 있을것이라고 기대된다.
