Cleavage site of HphI, a type IIS restriction endonuclease, were determined by using the mutant plasmids carding various nucleotide sequences around the cleavage site. Linear, radioactively labeled plasmid DNA was reacted with HphI under the standard assay conditions, and exact cleavage sites and relative cleavage activities at the cleavage sites were determined by sizing and quantitation of the resultant cleavage products. Contrary to the previous views, our results suggest that cleavage site can be shifted depending on the nucleotide sequences between the recognition and cleavage sites, rather than restricted to 8 base pairs away from the recognition sequence. In addition, there is no A:T or T:A base pair preference at the cleavage sites. Also, it was found that the cleavage activity was asymmetrical; the numbers of cleavage sites on two strands were different. All the plasmids having -TATA- from +4 to +7 show that cleavage site is located 9 bases away from the recognition in the upper strand, while others having TATC- or -TACC- show extra cleavage activity at the 8th base pair. The characteristic cleavage pattern of each plasmid was not affected by changing environmental conditions, such as ionic strength, glycerol concentration, pH, EtBr concentration, and temperature. These cleavage site shifts and asymmetrical cleavages can be interpreted as the results from the sequence dependent conformation changes of DNA double helix.
Type IIS 제한효소, HphI 의 절단위치를 절단위치 부근의 누클레오타이드 서열이 다양한 돌연변이 plasmids를 써서 정했다. Double digestion 결과 생겨난 절단산물을 고해상도의 polyacrylamide-urea 젤전기영동의 방법으로 크기비교 및 정량 함으로써, 미리 알고있는 누클레오타이드 서열로 부터 절단위치 및 절단위치 에서의 상대적인 활성도를 정하였다. 기존에 알려져 있는 특성과는 달리, 절단위치 에서의 A:T 또는 T:A 염기쌍에 대한 선호도는 없었으며, 절단위치도 인지부위로 부터 8 염기쌍만큼 떨어진 위치에 국한 되지 않고, 9, 심지어는 10 염기쌍 떨어진 위치에서도 절단이 일어남을 알았다. 또한 DNA 각 사슬에서의 활성이 다름을 두 사슬에서의 절단위치의 수가 서로 다르다는 사실로부터 유추할 수 있었다. HphI의 인지부위로부터 절단부위 사이의 염기서 열 중 +4 에서 +7 까지의 염기서열이 TATA 인 plasmids 의 경우엔 절단위치가 인지부위로 부터 9 염기쌍 떨어진 위치에서 절단이 일어났으나, 염기서열이 TATC 나 TACC 인 돌연변이 plasmids의경우 절단위치가 8 염기쌍 떨어진 위치에서도 활성이 있음을 알았다. 각 plasmid의 특징적인 절단 양식은 실험조건의 변화에는 무관하게 일정한 양상을 보였다. 따라서 위에서 언급한 절단위치의 변화 및 활성의 비대칭은 염기 서열에 따른 DNA의 구조적인 변화로부터 기인한 것으로 보인다.
