The lipase gene which previously cloned from Pseudomonas fluorescens SIK Wl in our laboratory was subcloned into expression vector, pTTQ 19 and expressed in E. coli JM 103. The pTTQ 19 vector contains a polylinker/lacZα flanked by the strong tac promoter and γγB transcription terminator, and contains the $lacl^q$ allele of the lac regressor gene to ensure optimal regulation. The lipase gene generated from pJH 92 (pUC 19 derivative harboring the lipase gene) was inserted into the polylinker region of this expression cassette, to give transnational fusion within the lacZα coding region. The resultant plasmid was named as pTTy 2.
When the culture of E. coli harboring pTTY 2 was induced with IPTG (final concentration 0.5 mM), high levels of the lipase were expressed from pTTY 2. The lipase of the total cell protein and was found exclusively in cytoplasm as an insoluble form. Aggregates of the insoluble form, termed inclusion bodies, were shown to be highly refratile under phase contrast microscope.
When the inclusion bodies which had no biological activity were solubilized with 8 M urea and then gradually dialyzed, lipolytic activity was recovered. And an exceeding 10 mg of crude lipase could be obtained in 100 ml culture.
본 실험실에서 기존에 Pseudomonas fluorescens SIK W1 로 부터 클론되었던 리파제 유전자를 발현벡터인 pTTQ 19로 서브클론하여 대장균내에서 발현시켰다. pTTQ 19 vector는 강력한 tac 촉진제를 가지고 있고 또한 $lacI^q$ 유전자를 가지고 있기 때문에 최적의 조절이 가능하다. 플라스미드 pJH 92 (리파제를 지닌 pUC 19 의 유도체) 로부터 얻은 리파제를 이 발현벡터의 polylinker 지역으로 삽입하였는데 이것은 번역융합을 제공해주었다. 결과로 얻어진 플라스미드를 pTTY 2로 명명했다.
리파제의 발현을 위해 pTTY 2를 지닌 대장균을 IPTG로써 유도하였을때 리파제가 대량으로 발현되었다. 이때 생성된 리파제는 전체 세포단백질의 37%에 상응되었고 세포질내에 불용성형태로 존재했다. 함유체 (inclusion bodies)라 불리는 불용성단백질의 응집물을 위상차현미경으로 관찰하였을때 굴절성을 지니고 있었다.
생물학적활성이 없는 함유체를 8 M urea로써 용해시키고 그런 다음 투석에 의해 urea를 제거하여 재결합시켰을때 리파제의 활성이 회복되었다. 그리고 100 ml 배양에서 10 mg 이상의 리파제 시료를 얻을 수 있었다.
