Hepatic stellate cells (HSCs) store about 80% retinol of our body as lipid droplets. The cells were involved in retinol homeostasis by controlling retinol storing. Especially in hepatic fibrogenesis, HSCs were activated and transformed to myofibroblast-like cells as well as lose their retinols. In there, the cells were interacted with various immune cells by metabolizing and secreting retinols, and controlled liver fibrosis. In injured liver, the remaining hepatocytes were proliferated to compensate injuries. Although morphology of the cell is similar, metabolically functional maturation process is needed. It is well known that hepatic stellate cells were involved to cellular differentiation. Hepatocyte-like cells (HLCs), derived from human embryonic stem cells and resembled with developing fetal hepatocytes must attained functional maturity to use of drug screening. In this study, we evaluate the effects of mouse HSCs (mHSCs) on the expression and activity of drug metabolic enzymes in HLCs. In microarray analyses, expressions of major drug metabolic enzymes in HLCs were specifically down-regulated compared with primary human hepatocyte. However, metabolic enzyme expressions were significantly increased in co-cultured HLCs with retinol-storing mHSCs. Chenodeoxycholic acids (CDCAs) were secreting from HLCs and it activates farnesoid X receptor (FXR) of mHSCs. As a result, retinol storage gene expression in co-cultured mHSCs was down-regulated, while retinol production and delivery gene expressions were significantly increased by effect of FXR activation. In contrast, retinoic acid deficient LX-2, hTERT and Raldh1-depleted HSCs did not affect expression of metabolic enzymes in HLCs, suggesting that retinoic acid might be a crucial factor for functional maturation of HLCs. In western blotting, protein levels of CYP1A2, CYP2E1, and CYP3A4 were increased in co-cultured HLCs. In consistent with protein levels, metabolic activities of CYP1A2 and CYP3A4 were significantly improved in co-cultured or retinoic acid-treated HLCs. Therefore, co-culturing with mHSCs or treatments of retinoic acids could be useful ways to adapt immature HLCs for the application of drug toxicity screening system. However, the most important thing is that CDCA secreted from HLCs trigger the activation of retinol metabolic signaling in mHSCs.
In addition, accumulating evidence suggests that retinol and its metabolites are closely associated with liver fibrogenesis. Recently, we demonstrated that genetic ablation of alcohol dehydrogenase 3 (ADH3), a retinol metabolizing gene that is expressed in hepatic stellate cells (HSCs) and natural killer (NK) cells, attenuated liver fibrosis in mice. In the current study, we investigated whether pharmacological ablation of ADH3 has therapeutic effects on experimentally induced liver fibrosis in mice. Liver fibrosis was induced by intraperitoneal injections of carbon tetrachloride ($CCl_4$) or bile duct ligation (BDL) for two weeks. To inhibit ADH3-mediated retinol metabolism, $10 \mu g 4$-methylpyrazole (4-MP)/g of body weight was administered to mice treated with $CCl_4$ or subjected to BDL. HSCs and NK cells were isolated from control and treated mice livers for molecular and immunological studies. Treatment with 4-MP attenuated $CCl_{4-}$ and BDL-induced liver fibrosis in mice, without any adverse effects. HSCs from 4-MP treated mice depicted decreased levels of retinoic acids and increased retinol content than HSCs from control mice. In addition, the expression of $\alpha$-SMA, transforming growth factor-$\beta 1$ (TGF-$\beta 1$), and type I collagen $\alpha 1$ was significantly reduced in the HSCs of 4-MP treated mice compared to the HSCs from control mice. Furthermore, inhibition of retinol metabolism by 4-MP increased interferon-$\gamma$ production in NK cells, resulting in increased apoptosis of activated HSCs. Based on our data, we conclude that inhibition of retinol metabolism by 4-MP ameliorates liver fibrosis in mice through activation of NK cells and suppression of HSCs. Therefore, retinol and its metabolizing enzyme, ADH3, might be potential targets for therapeutic intervention of liver fibrosis.
The HSCs were taken major roles controlling in hepatic fibrosis by regulating retinol metabolism and by controlling retinol metabolizing enzyme expression, it is possible that hepatic fibrosis is effectively controlled. In addition, the hepatic stellate cells were involved in the maturation of developing hepatocytes by controlling FXR-mediated retinoic acid signaling and it is applied to hepatocyte-like cell for using as drug screening tools.
Part 1. FXR 매개 레티노익산의 약물 대사에 대한 간 유사세포의
성숙 향상 기전 연구
사람 배아줄기세포 유래 간 유사세포는 약물 개발 스크리닝에 이용할 수 있는 유용한 도구이지만, 대사 기능이 사람 간세포에 비하여 현저히 뒤떨어지므로 대사 기능의 향상이 필요하다. 레티노익산 (비타민 A 유도체)은 간내 간성상세포에 우리 몸 전체의 약 80 % 를 차지하고 있는데, 체내에서 기관 발달과 함께 대사기능의 조절에도 중요한 역할을 담당한다. 본 연구에서는, 마우스 간성상세포가 간 유사세포의 약물 대사효소의 발현과 그 기능에 미치는 영향을 평가하고자 연구를 진행하였다.
우선, 유전자 미세배열기술 (microarray)을 이용한 분석결과, 간 유사세포의 주요 약물대사 효소의 발현은 성인 간세포에 비해 현저히 낮음이 확인되었다. 그러나 레티놀을 함유하고 있는 마우스 간성상세포와 공동배양시에 이들 효소의 발현이 상승하였다. 그 기전으로는, 1차 담즙산 중 강력한 FXR 작용제인 케노데옥시콜산 (chenodeoxycholic acid)이 간 유사세포에서 충분량 분비되어 간성상세포의 FXR (farnesoid X receptor) 수용체를 활성화시켜 레티노익산을 분비시키기 때문인 것으로 확인되었다. 반면에, 레티노익산이 결여된 사람 간성상세포주인 LX-2나 hTERT, 혹은 레티날데히드 탈수소효소 1형 (retinaldehyde dehydrogenase 1)이 결여된 마우스 간성상세포와 공동배양을 시행한 경우에는 간유사세포의 대사 효소의 향상에 영향을 미치지 못했다. 이는 레티노익산이 간 유사세포의 대사기능 향상에 주요한 인자로 작용하기 때문임을 재확인하였다. 단백 정량분석 검사 (Western blotting)에서, 사이토크롬 P450 효소군의 1A2형과 2E1, 그리고 3A4 형의 경우 간성상세포와 공동배양시 그 발현이 증가함이 확인되었다. 또한, 단백발현의 증가와 마찬가지로 사이토크롬 P450 효소군 중 1A2와 3A4 의 약물대사 활성이 간성상세포와 공동배양하거나 레티노익산을 처리하였을 때 향상됨을 확인하였다.
한편, 유세포 분석검사에서, 조심스럽게 분리한 간 유사세포들을 세포의 크기와 과립 함유 정도로 분석하였을 때, 세 가지 군으로 분리가 되었다. 그 중에서 세포 크기가 크고 과립 함유 정도가 많은 두 군의 경우 약물 대사 효소 발현이 높았으나, 세포의 크기가 작은 나머지 군의 경우에는 여전히 중간엽 표지자의 발현이 높은 것으로 보아 아직 성숙하지 못한 불완전한 세포임이 확인되었다.
결과적으로 레티놀을 함유하고 있는 간 성상세포는 레티노익산 매개 대사효소 증가와 약물 대사효소의 활성 증가를 통해 간 유사세포의 대사기능의 성숙에 기여한다. 그러므로, 간 성상세포와의 공동배양 혹은 보다 실질적으로는 레티노익산의 처치를 통해, 아직 완전히 성숙하지 못한 간 유사세포의 성숙에 기여하여, 약물 독성 스크리닝 평가에 이용할 수 있게 하는 유용한 방법이 될 수 있을 것이다.
Part 2. 4-메틸피라졸을 이용한 간성상세포와 자연살해세포 조절을 간섬유화 억제 기전 연구
최근 연구들에 따르면 간섬유화에 있어서 레티놀과 그 대사 산물들이 밀접하게 관련되어 있음이 알려져 있다. 그러나, 체내 약 80% 의 레티놀을 저장하고 있는 간성상세포의 레티놀 대사는 잘 알려져 있지 않고 레티놀과 그 대사물들이 간내 염증반응에서 중요한 면역세포들의 역할 또한 잘 알려져 있지 않다. 최근에 간성상세포 및 자연살해세포의 레티놀 대사에서 알코올 대사효소 3 (ADH3)의 중요성이 보고되었는데, ADH3 가 결여된 마우스는 사염화탄소 유도 및 총수담관결찰 유도를 통한 간섬유화 모델에서 대조군 마우스에 비해 간 섬유화와 콜라겐 축적이 감소하였다. 현재 임상에서 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol) 이나 메탄올 (methanol) 중독 환자의 경우에만 제한적으로 이용되는 4-methylpyrazole (4-MP)는 비특이적으로 알코올 대사효소 억제 기능이 있고 세포 수준에서도 알코올 대사효소를 억제한다는 보고들이 있다. 따라서 본 연구를 통해서 4-MP의 알코올 대사효소 억제기능을 이용하여 간성상세포의 억제와 자연살해세포의 활성화를 통한 간섬유화의 치료 타겟으로서의 가능성을 제시하고자 한다. 실험 동물 모델로서는 사염화탄소 및 총수담관결찰을 통한 간섬유화 모델을 만들었고, 체내에서 알코올 대사효소를 억제하기 위해 마우스 복강에 4-MP를 주입하였다. 가장 먼저는 4-MP의 약물로서의 사용 가능성을 평가하기 위해 체내 독성을 유발하지 않는 농도를 알아내고자 농도 의존적으로 복강 내 투여를 시행하였다. 그 결과, $10 \mu g/g$ 의 4-MP 투여는 간손상을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 이후 $10 \mu g/g$ 농도의 4-MP를 간섬유화 실험에 사용하였고 2주동안 사염화탄소 및 총수담관결찰을 시행한 간섬유화 모델에서 항섬유화 효과가 있는 것을 시리우스 레드 (Sirius red) 염색과 면역화학염색을 통해 알 수 있었다. 또한, 4-MP에 의하여 알코올 대사효소가 억제되면 간내 자연살해세포의 인터페론 감마의 발현이 증가하여 활성화된 간성상세포가 사멸하거나 자멸사하게 되는 것을 확인하였다.
이와 같은 실험 결과를 바탕으로, 4-MP를 이용한 알코올 대사효소 억제는 간성상세포의 활성화의 감소와 자연살해세포 활성화의 촉진 등의 기전으로 간섬유화의 진행을 억제하는 것을 밝혀내었다. 따라서 본 연구에서는 간섬유화에 대한 4-MP의 치료적 타겟으로서의 가능성을 제시하고자 한다.
