The Hippo pathway has emerged as tumor suppressors by regulating self-renewal and differentiation of various adult stem cells. Mice with liver specific deletion of Hippo components (Sav1, Nf2, Mst1/2) commonly develop hepatomegaly, hyperproliferation of biliary/progenitor cells and hepatomas. However, roles of Hippo signaling in the cell fate determination and differentiation during liver development are not fully understood in vivo. Here, we investigate the effects of altered endogenous Yap (Yes-associated protein) and Taz (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) activity by deleting both Lats1 and Lats2 (large tumor suppressor1 and 2) kinases, direct upstream regulators of Yap/Taz, on cell fate determination and properties in the liver. In embryonic liver, Yap/Taz activation by loss of Lats1/2 forces hepatoblasts to commit to biliary epithelial cells (BECs) and also to increase their proliferation, but suppresses differentiation of hepatoblasts into hepatocytes. In adult liver, acute Lats1/2 deletion in liver led to transition of hepatocytes to progenitor/biliary cells, and expansion of BECs. Of interest, oncogene Yap/Taz activation by acute Lats1/2 deletion in adult hepatocytes also induces hepatic senescent large cell changes and p53-dependent cell death. We discover that highly activated Yap/Taz suppresses hepatic differentiation via directly repressing $Hnf4\alpha$ expression. Additionally, active Yap/Taz also upregulates $Tgf\beta$ signaling, contribute to BEC differentiation, expansion of fibroblasts and suppression of hepatic differentiation. Together, our results suggest that the extents of Yap/Taz activities define cells to differentiate into which lineage of liver cells and furthermore, cells to proliferate or not in context dependent manners.
수정란에서부터 성체가 될 때까지 무수히 많은 세포의 분열과 분화가 일어난다. 발생기 동안 줄기 및 전구세포의 분열 및 분화를 조절하는 인자들의 상당수는 성체가 된 후에도 조직의 재생이나 암발생 과정에서도 역할을 한다. Hippo pathway와 그 작용자인 전사조절도움인자 YAP/TAZ는 초파리에서부터 규명된 조직크기조절 가능 회로로 주목을 받았으며, 그 구성인자들이 포유류에서도 잘 보존되어 성체줄기세포의 분열 및 분화, 세포계통결정, 암 발생 등의 조절 역할이 연구되고 있다.
Hippo pathway의 가장 중요한 인자인 LATS1과 LATS2 인산화 효소는 활성화되어 YAP/TAZ 단백질을 인산화시킴으로써 비활성 및 분해를 촉진시킨다. LATS1/2 를 조절하는 canonical Hippo pathway 요소들인 Nf2, MST1/2, SAV1 유전자 결손 생쥐는 나이가 듦에 따라 자연적으로 간암이 발생하면서 성체간줄기세포/전구세포가 증가하는 것이 보고되었다. 간 특이적YAP 과발현 마우스 또한 간세포가 증식하여 간암이 발생하였으며, 간암 환자의 간조직에서 조직에서 YAP이 과발현 되어있다는 결과들을 토대로 Hippo pathway가 암 억제 신호전달 회로로써 기능할 수 있음이 제시되었다.
간을 이루는 대부분의 세포는 간세포로 포도당, 아미노산, 지방산, 유해물질 등의 여러 가지 물질을 대사하며, 또한 삼투압조절에 중 알부민 등의 혈청 단밸질과 담즙을 구성하는 요소인 빌리루빈을 생성하는 세포이다. 간세포에서 생성된 빌리루빈은 간내 담도세포가 이루는 담관으로 모여 쓸개로 이동하여 담즙을 만들게 된다. 간세포와 담도세포는 모두 태아 간 발생기에 간모세포에서부터 분화하여 생성된다. 많은 연구자들은 한 가지 전구세포로부터 분화된 세포들이 서로 보완하여 재생할 수 있는지 아니면 성체 간에 남아있던 전구세포가 새로운 두 가지 성격의 세포를 만들어 내는지에 대한 의문을 가지고 연구를 진행하고 있다. 성체의 간세포에 YAP을 과발현 하였을 때, 담도세포 성격을 띠는 성체간전구세포로 역분화한다는 보고가 발표되었다.
그러나 성체간전구세포는 간담도세포와 비슷한 성격을 가지므로 이것이 정확히 담도세포인지 아니면 성체간전구세포인지는 명확하지 않다. 또한, YAP 뿐만 아니라 TAZ도 이러한 기능을 할 수 있는지와 어떤 신호전달회로와 상호작용을 하는가, 그리고 간 발생기에는 어떠한 영향을 미치는 지에 대하여는 아직 밝혀지지 않았다.
본 연구는 이러한 Hippo pathway의 핵심 조절자인 LATS1/2를 결손시킨 태아 그리고 성체 마우스와 생체 외 간모세포배양 시스템을 이용하여 간 발생과 그 후의 YAP/TAZ의 기능을 다음과 같이 제시한다.
배아기 14.5일의 정상 배아와 간특이적 Lats1/2 결손 배아에서 간으로부터 분리한 간모세포를 각각 간세포와 간담도세포로 분화시켰을 때, Lats1/2 결손에 의한 Yap/Taz의 활성화됨과 동시에 간세포로의 분화는 억제되며 담도세포로의 분화는 증가되었다. 이러한 세포들에서 추출한 mRNA로 전 유전체 분석법인 RNA-sequencing를 수행하였을 때 성체간세포에서 성체간모세포로의 전환 시 YAP의 타겟이라고 보고된 Notch pathway의 mRNA발현정도는 변하지 않았다. Notch pathway와 Hippo pathway의 기능을 면밀히 비교하기 위하여 활성화 형태인NICD 과발현 생쥐와 Yap/Taz 활성화가 유도되는 Lats1/2 결손 생쥐의 간 발생을 비교해보았다. 그 결과 NICD 과발현 생쥐에 비해 Lats1/2 결손 생쥐에서 간모세포에서 간담도세포로의 분화가 촉진되었며 NICD 과발현 마우스와는 다르게 기능적으로 정상인 간세포는 생성되지 않고 담관을 형성하지 못한 간담도세포의 무분별한 증식이 관찰되었다. 이러한 Lats1/2 결손 마우스에서 보이는 표현형은 Notch pathway의 하위 전사조절인자인 Rbpj 를 결손하여도 여전히 나타났으며, Yap과 Taz 를 모두 결손하였을 때에만 정상 간발생으로 되돌아왔다.
생체 외 배양세포로 수행한 RNA-sequencing 결과에서 새롭게 $Tgf\beta$ pathway가 극적으로 증가함이 보였으며 Lats1/2 결손 배아도 마찬가지로 간담도세포 분화에 중요한 역할을 하는 $Tgf \beta$ pathway가 증가하였으며 그 중 공통적으로 가장 상위 신호전달자인 $Tgf \beta2$ 의 mRNA가 특이적으로 증가하였다. ChIP assay를 통해 Yap이 Tgfβ2 염색체의enhancer 부위에 결합할 수 있음을 확인하였고, $Tgf\beta$ 억제물질을 처리하여 Lats1/2 결손 간모세포를 간담도세포로 분화시켰을 때 담도세포로의 분화가 저해되었다.
간 발생기뿐만 아니라 성체 간에서도 $Tgf\beta2$ 의 증가가 담도세포로의 전환에 중요한지 관찰하기 위하여, adeno-cre 바이러스를 정맥 주입하여 성체 간 특이적 Lats1/2 결손 생쥐를 확보하였다. 이 생쥐는 결손을 유도한지 2주 후부터 심한 혼수증상을 보였고 간이 정상 생쥐에 비하여 두 배에서 세 배 가량 크기가 증가하였다. 그 구성 세포를 살펴보니 대부부분이 cytokeratin7, 19 를 발현하는 담도세포였으나 배아 간과 마찬가지로 완벽한 담관을 형성하지는 못하였고, 다량의 섬유화세포와 면역세포 또한 관찰되었다. 이전 보고들과는 다르게 간암이나 간세포의 증식은 보이지 않고 오히려 비정상적으로 커진 간세포가 관찰되었고 이 세포들은 p21을 발현하며 세포질뿐만 아니라 핵상 또한 증가하였다.
기존 보고에 의하면 이러한 간세포의 커짐 현상은 간암 발생 전 형질전환이 일어나는 세포나 혹은 세포 노화/사멸 직전의 상태를 대변하는 것이라 알려져 있다. Lats1/2 결손 간세포가 보인 큰 간세포는 노화의 대표적 표지인 p21을 발현하며 분열표지에는 음성으로 노화/사멸 상태의 세포임을 확인하였다. 이러한 Lats1/2에 의한 노화 현상이 간세포 특이적인지 확인하고자 Lats1/2 결손 섬유아세포를 관찰하니 이 세포 또한 세포 크기 및 염색체 배수성이 증가하고 계대배양이 지속될수록 사멸하였다. 세포노화를 유도하는 가장 중요한 p53 pathway 결손 생쥐와 Lats1/2 결손 생쥐를 교배하여 간세포암이 발생하는지 추적하였으나 세 유전자 결손 생쥐의 간세포는 분열지표에 양성이며 p21발현은 억제되었지만 여전히 세포의 크기는 커져있고 간세포암은 발생하지 않았다. 생체 외 간모세포 배양 중에도 세포커짐 현상이 나타났으나 Lats1/2/p53 세 유전자 결손 간모세포 또한 간세포로의 분화가 억제되었다.
마지막으로, Yap/Taz의 간세포 분화 억제 기전을 찾기 위해 RNA-sequencing 결과를 분석해보니, 담도세포로의 분화 조건에서도 정상세포에 비해 Lats1/2 결손 세포에서 간세포분화에 가장 중요한 인자인 $Hnf4\alpha$ 발현이 감소한 것을 확인하였다. 이것이 최근 밝혀진 Yap의 새운 역할인 직접적 전사억제에 의한 것인지를 확인하기 위해 ChIP 분석법을 수행하였고 그 결과 $Hnf4\alpha$ 유전체의 전사조절부위에 Yap과 전사억제복합체 요소 중 하나인 Chd4가 결합한 것을 확인하였다.
이 결과들을 통해, 간 발생 동안과 그 후에 Lats1/2 단백질은 Yap/Taz 활성화를 제어하여 $Tgf\beta$ pathway와 $Hnf4 \alpha$ 발현을 조절함으로써 간세포나 간담도세포로의 계통을 결정한다는 것을 제시한다. 또한, 간세포나 섬유아세포 등 특정 세포에서 Lats1/2의 결손이나 Yap의 과활성으로 분열신호가 전달되면 과도한 mRNA 및 리보좀 단백질 합성 증가로 인해 세포주기 점검점인 p53 pathway가 활성화되어 결국 세포 노화나 사멸이 발생할 수 있음을 제시한다.
