SNARE complex is an essential component of intracellular membrane fusion, a fundamental phenomenon in biological processes. It is known that synaptoagmin-1 (syt1) as a $Ca^{2+}$ trigger is a key protein for membrane fusion. Nevertheless, the effect of SNAREs and syt1 reconstituted into vesicles is still veiled. Here, I did research about the function of SNAREs and synaptotagmin-1, respectively, using single and bulk vesicle interaction system. The SNARE complex was not related to $Ca^{2+}$, but syt1 did by penetration to t-vesicles. In addition, transmembrane domain of syt1 is a critical factor for membrane fusion as well as C2AB domain of it.
Inositol pyrophosphates such as $5-IP_7$ (5-diphosphoinositol pentakisphosphate) are highly energetic inositol metabolites containing phosphoanhydride bonds. While inositol pyrophosphates are known to regulate various biological events, including growth, survival and metabolism, the molecular sites of $5-IP_7$ action in vesicle trafficking have remained largely elusive. Based on results of PC12 cells and hippocampal neurons, employing a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based in vitro vesicle fusion assay, I found that $5-IP_7$, but not $1-IP_7$, exhibited significantly higher inhibitory activity toward synaptic vesicle exocytosis than did inositol hexakisphosphate ($IP_6$). syt1 essential for synaptic membrane fusion, was identified as a molecu-lar target of $5-IP_7$. Notably, $5-IP_7$ showed a 45-fold higher binding affinity for syt1 compared with $IP_6$. In addition, $5-IP_7$-dependent inhibition of synaptic vesicle fusion was abolished by increasing $Ca^{2+}$ levels. Thus, $5-IP_7$ appears to act through syt1 binding to interfere with the fusogenic activity of $Ca^{2+}$. These findings reveal a role of $5-IP_7$ as a potent inhibitor of syt1 in controlling the synaptic exocytotic pathway and expand our un-derstanding of the signaling mechanisms of inositol pyrophosphates.
스네어 복합체는 생물학적인 절차에 기본적인 현상인 막융합에 필수적인 요소로 알려져 있다. 또다른 중요한 단백질 시냅토태그민1은 칼슘센서로서 막융합을 빠르게 가져갈 수 있도록 도움을 준다고 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 스네어 단백질들과 시냅토태그민1의 효과를 더 자세히 알아볼 필요가 있다. 그래서 시냅토태그민1과 스네어 단백질들을 개별적으로 나누어서 그 기능을 확인해보기위해 단일 소포체 또는 다량 소포체 융합 기술을 통해 막융합의 상호관계를 알아보았다. 스네어 복합체가 칼슘 유입과 무관하지만, 시냅토태그민1은 칼슘유입에 관여해 반대편 막을 침투하여 소포체를 인접하게 하고 스네어 복합체가 막융합을 이끌 수 있도록 도와준다.
한편, $5-IP_7$ 과 같은 이노시톨 파이로포스페이트는 매우 많은 에너지를 가지고 있으며, 성장, 생존, 신진대사에 이르기까지 다양한 생물학적 현상을 조절한다고 알려져 있다. 그러한 $5-IP_7$ 은 막융합에도 관여하지만, 그 역할에 대해서는 자세히 알려져 있지 않기 때문에, 그 역할에 대해서 알아보았다. 세포 밖에서 $5-IP_7$ 의 역할을 알아보기 위해 나는 형광측정 및 FRET현상을 소포체 융합 기술 이용하였다. $5-IP_7$은 막융합을 방해하는 역할을 하였는데, $1-IP_7$ 이나 $IP_6$ 에 비해 훨씬 큰 효과를 가져왔다. 그 원인은 시냅토태그민의 C2B와의 결합 때문인 것으로 나타났으며, 놀랍게도 $5-IP_7$ 이 C2B에 결합하는 정도는 $IP_6$ 에 비해 45배나 높게 나타났다. 게다가, $5-IP_7$ 은 칼슘 유입과 상관관계를 가지고 있어, 다량의 칼슘이 유입될 경우 그 기능을 잃어버릴 수 있기 때문에, 시냅토태그민1과 결합하기위해 두 물질간의 경쟁 관계도 있을 것으로 예상된다. 하지만, 칼슘이 없을 때에도 막융합을 저해시키는 $5-IP_7$ 이기 때문에, 경쟁관계를 넘어서 시냅토태그민 자체를 손상시키지 않을까 예상하고 있다. 위의 결과는 공동연구팀의 PC12 세포나 해마신경세포에서 나타난 결과로써 그 신빙성을 더하고 있다.
이와 같은 결과로써, $5-IP_7$ 의 역할은 막융합을 조절하는 시냅토태그민1을 방해하는 것으로 예상할 수 있기 때문에 이노시톨 파이로포스페이트의 신호전달 체계를 이해하는 데 도움이 될 것으로 예상된다.
