E. coli is a good model with which to study the functions of DEAD-box proteins, due to the reactions in which they participate, i.e., ribosome assembly and mRNA degradation. E. coli possesses five such proteins, DbpA, DeaD, RhlB, RhlE, and SrmB, in which the helicase core is flanked with C-terminal extensions of various lengths. In E. coli, only four DEAD-box proteins are involved in ribosome biogenesis. Of the five E. coli DEAD-box proteins, RhlB is part of the bacterial degradosome, a multi-protein complex involved in the RNA degradosome. In many model organisms, several DEAD-box proteins have also been found to be essential. In contrast, none of the five E. coli DEAD-box proteins is required for rapid growth at $37^\circ C$. From the results of in vivo and in vitro experiments, I identified the interconversion of DEAD-box proteins. An analysis of the function of RNA helicases is difficult because these features and the precise substrates and sites of action remain unknown for most of them. I expect that RNA helicases interact with sRNA and participate in RNA metabolism. To verify this assumption, I applied a gene-silencing system to an analysis of the roles of RNA helicases. The abundance of artificial small RNA (afsRNA) ARlacZ1 with a SibC-derived scaffold was increased by only rhlB deletion in contrast to dSL6 with its double-stem-loop (dSL) scaffold. An increase in the ARlacZ1 level was induced by blocking the degradation by RNase III / E. The increased ARlacZ1 also underwent base-pairing with other target mRNAs, after which the base-paired mRNAs were degraded by RNase. These results demonstrated that RhlB recognizes the target sRNA and helps RNase E to degrade sRNA, mRNA, or both. Another experimental approach was the construction of a DEAD-box gene multiple-deletion strain and a search for the target sRNA of RNA Helicases at a low temperature using these mutation strains. DeaD and SrmB are essential proteins at low temperatures. The removal of rhlE did not alter the growth process at either $37^\circ C$ or$ 25^\circ C$, but the $\Delta deaD$ and $\Delta srmB$ strains showed the opposite effect, with rhlE deletion during the growth process. I used this feature to find the target sRNAs of RNA helicase proteins. The abundance and stability of sRNAs individually changed in DEAD-box gene multiple-deletion strains at low temperatures. A comparison of DsrA and GlmZ as induced by a cold shock showed the opposite propensity. An intracellular level change was found in only DsrA among RprA, ArcZ, and DsrA known to be activators of rpoS expression. The results of this study distinctly indicate that RNA helicases specifically target certain sRNAs and participate in sRNA processing through the regulation of the stability and abundance of sRNA.
대장균은 RNA 나선효소의 기능을 연구하는데 좋은 유기생명체이다. 대장균에서 발견되는 RNA 나선효소는 DbpA, DeaD, RhlB, RhlE, SrmB 5종류이며, 이 중 4개는 라이보좀 생합성에 관여하고 있고, RhlB는 데그라도좀 (degradosome) 의 구성성분으로 리보핵산 가수분해 효소 E와 결합하여 mRNA의 분해에서 RNA의 구조를 풀어 mRNA의 분해를 돕는 기능을 한다. RNA 나선효소의 기능은 대장균의 생존에 있어서 반드시 필수적인 것은 아니다. DEAD-box 단백질을 합성하는 gene을 제거하여도 대장균의 성장에 영향을 주지 않으며, 5개의 모든 RNA 나선효소를 발현하는 유전자를 제거하여도 정상온도에서 성장변화가 나타나진 않는다. 또한, in vivo 와 in vitro 실험 결과들로 부터 RNA 나선효소들이 서로의 기능에 영향을 주며, 상호보완을 할 수 있음을 확인하였다. 이러한 RNA 나선효소의 특징은 나선효소의 기능 연구를 어렵게 하였다. 유전자표현형의 관찰이 어렵고, 나선효소와 상호작용하는 mRNA, sRNA, 단백질들을 찾기 어렵기 때문이다. 우리는 이 연구에서 sRNA가 RNA 나선효소와 상호작용하며, sRNA의 안정화와 대사회전과 같은 RNA 대사에 관여할 것이라고 예상했고, 우선 이를 증명하기 위해 Hfq 독립적인 유전자 침묵 시스템을 사용하여 sRNA와 mRNA의 염기쌍 형성에 있어서 RNA 나선효소의 역할을 증명하였다. 5개의 RNA 나선효소와 유전자 침묵 시스템의 연관성을 조사하기 위해 RNA 나선효소 유전자를 제거한 대장균을 사용하여 인공 sRNA가 나선효소에 의해 영향을 받는지 노던식 빨아들이기법으로 인공 sRNA의 양적 변화를 관찰하였다. 5개의 나선효소 중 RhlB에서만 인공 sRNA의 양이 변하는 것을 관찰할 수 있었고, 인공 sRNA 중 ARlacZ1에서 그 변화가 가장 뚜렷하였다. rhlB의 제거로 인해 인공 sRNA인 ARlacZ1의 양이 증가하였고, mRNA와 염기쌍 형성을 통해 mRNA의 분해를 야기함으로써 유전자 침묵이 더욱 강하게 나타났다. 그러나 다른 골격을 가지는 인공 sRNA인 dSL6의 경우에는 염기쌍의 형성 유무와 상관없이 RhlB와 상호작용을 하지 않는 것을 관찰하였다. RNA 안정성을 확인한 결과 ARlacZ1이 dSL6보다 불안정함을 확인하였고, 리보핵산 가수분해 효소 E와 III에 의한 ARlacZ1의 분해가 원인임을 알 수 있었다. ARlacZ1과 dSL6에 대한 RhlB의 식별이 어떻게 가능한지 조사하기 위해 타겟인 mRNA와 결합하는 인공 sRNA의 염기서열과 인공 sRNA의 2차구조에 변화를 주는 실험을 수행하였다. 그 결과 인공 sRNA의 5′ 말단의 스템-루프 (stem-loop) 구조가 sRNA의 안정화와 밀접한 관계가 있으며, sRNA의 구조와 염기서열의 변화가 RhlB와 상호작용에 영향을 주는 것을 확인하였다. 또한 in vivo와 in vitro 에서 DMS와 SHAPE NAI에 의한 sRNA 염기의 화학적 반응을 통해 ARlacZ1과 dSL6의 3차 구조를 비교해 보았고, 3D 계산 예측을 통해 분석하였다. 이 결과로 부터 ARlacZ1의 5′ 말단의 스템 루프 구조가 dSL6에 비해 유연하고 개방적이어서 RhlB의 접근이 용이함을 알 수 있었고, 프라이머 익스텐션 (primer extension) 의 실험에서 얻은 패턴의 분석결과와도 일치하였다.
RNA 나선 효소의 기능을 알기 위해 사용한 또 다른 접근방법은 DEAD-box 유전자를 다중 제거하고, 정상온도가 아닌 저온에서 대장균을 성장시키면서, sRNA의 양적 변화를 관찰, RNA 나선효소의 타겟을 탐색하는 것이다. DEAD-box 유전자를 다중제거함으로써 RNA 나선효소간의 상호보완적 기능을 배제하고, 저온에서 성장시킴으로 RNA 나선효소의 기능의 필요를 극대화 시켰다. DEAD-box 유전자의 제거와 저온성장은 대장균의 성장에 변화를 가져왔다. 그리고 정상온도에서 DEAD-box 유전자의 제거가 대장균의 성장에는 영향을 주지 않지만, sRNA의 양적 변화를 일으켰다. 또한 다중 유전자 제거에 의해 유전자의 제거되는 수가 증가할수록 sRNA의 양적변화에 증가 또는 감소하는 패턴이 나타나는 것을 관찰하였다. 그러나 sRNA의 종류와 성장 단계, 성장 온도 조건에 따라 그 변화는 다르게 나타났다. 저온에서 발현이 유도되는 DsrA와 GlmZ sRNA를 비교하였을 때, 저온의 스테이셔너리 단계 (stationary phase)에서는 DEAD-box 유전자 제거 개수가 증가하면 DsrA의 양은 감소하지만, GlmZ의 경우 정상온도에서는 감소를 보이던 경향성이 저온에서는 증가하는 반대의 경향성을 보인다. RNA 나선효소의 종류와 무관하게 제거된 유전자의 숫자가 sRNA의 양적 변화를 일으키는 요인인지 조사해보자 하였고, 그 결과 제거된 유전자의 수와 상관없이 제거된 유전자의 종류가 중요함을 알 수 있었다. 또한 여러 종류의 sRNA들을 사용하여 RNA 나선효소와 sRNA의 관계를 알아보았다. rhlE 제거가 정상온도와 저온 모두에서 대장균의 성장에 아무 영향을 주지 않지만, deaD와 srmB와 함께 제거가 되면 리보좀 생합성과 rRNA의 성숙이 잘 이루어지지 않는다는 연구 결과가 있어 rhlE, deaD, srmB의 제거와 이중제거의 결과 나타나는 sRNA의 양적 변화도 비교해 보았다. 같은 RNA 나선효소라도 sRNA가 다르면 양적변화는 다르게 나타난다. 예를 들어 ArcZ와 GlmZ, GadY는 rhlE가 제거되면 양이 크게 변하지 않지만, RyeA의 양은 감소한다. sRNA의 stability에서 변화가 나타났다. GlmZ의 경우 dbpA, dead 제거로 인해 분해 속도가 증가하고 DsrA의 경우 dbpA와 srmB 제거로 인해 분해속도가 증가하는 것을 확인하였다. deaD와 srmB 와 함께 rhlE를 제거하였을 때 나타나는 변화도 sRNA에 따라 다르게 나타난다. rhlE와 deaD를 제거하였을 때 RyeA는 증가하지만, GadY는 감소한다. 이 결과들로부터 sRNA의 안정화와 분해로 인한 양적 조절에 RNA 나선효소가 작용하고 있으며, 그 조절의 방향이 다르다는 것을 알 수 있다. rhlB가 제거된 대장균에서 96개의 sRNA를 과발현시키고, sRNA의 양적변화를 분석한 결과, 각각의 sRNA마다 증가 또는 감소가 나타났다. RNA 나선 효소의 기능이 고정된 것이 아니며, sRNA마다 특정한 기능을 하고 있음을 알 수 있다. 비록 과발현으로 인해 대장균의 성장저해가 일어나는 등 in vivo와 같은 조건은 아니지만, RNA 나선효소가 sRNA를 타겟으로 하며, sRNA 대사에 관여함을 알 수 있다.
유전자 침묵 시스템을 이용한 실험과 DEAD-box 유전자 다중제거 및 저온자극, sRNA 과별현 실험을 통해 RNA 나선효소가 sRNA의 전사단계의 조절과 분해에 관여하고 이를 통해 단백질 발현을 조절하며, 성장저해도 일으킬 수 있음을 알았다. RNA 나선 효소가 특정한 구조와 염기서열을 갖는 인공 sRNA와 반응하여 sRNA의 양적변화를 가져오고 이를 통해 단백질 합성을 조절함을 밝혔다. 그러나 정확한 sRNA와 RNA 나선효소의 상호작용 메커니즘을 알기 위해서는 RNA 나선효소의 발현을 조절하는 요인을 아는 것이 중요하며, 이를 통해 대장균의 RNA 대사조절을 더 잘 이해하고 활용할 수 있을 것이라 기대한다.
