We demonstrate a centrifugal direct recombinase polymerase amplification (direct-RPA) microdevice for multiplex and real-time identification of food poisoning bacteria from milk samples. The microdevice is equipped with triplicate functional units and each unit has four reaction chambers, thereby making it possible to perform twelve reactions simultaneously. The integrated microdevice consists of two layers: the samples were injected into a sample reservoir of a bottom layer, and the RPA reagents were injected into a top layer. For multiplex bacterial detection, the target specific primers and probes were freeze-dried in each reaction chamber. The injected samples and reagents could be equally aliquoted and dispensed into each reaction chamber by centrifugal force, and then the multiplex direct-RPA reaction was executed. The target genes of bacteria spiked in the milk could be amplified at $39 ^\circ C$ without DNA extraction step by using the direct-RPA cocktails, which were the combination of a direct PCR buffer and RPA enzymes. As the target gene amplification proceeded, the increased fluorescent signals of the reaction chambers were recorded every 2 min for real-time analysis. The entire process, including the sample distribution, the direct-RPA reaction, and the real-time analysis, were accomplished with a custom-made portable genetic analyzer and a miniaturized optical detector. Three kinds of food poisoning bacteria (Salmonella enterica, E.coli 0157:H7, and Vibrio parahae-molyticus) were successfully detected even with a detection sensitivity of single cell within 30 min. Monoplex, duplex, and triplex bacteria detection was successfully conducted with high selectivity. By combining the direct PRA on the integrated microdevice, the proposed miniaturized genetic analysis system can provide an advanced on-site food poisoning bacteria analysis platform with high speed, sensitivity, and multiplicity.
식중독은 음식이 제대로 조리되지 않았거나 잘못 보관 되었을 때 음식물 안에서 자라게 되는 인체에 유해한 미생물 또는 유독물질에 의하여 생기는 질병으로 구토, 설사, 복통 등을 유발하며 많은 사람들의 건강을 위협하고 있다. 식중독의 주요 원인인 식중독 박테리아는 빠르게 증식하기 때문에 식품의 안전과 사람들의 건강을 위하여 빠르고 정확하게 박테리아를 검출할 수 있는 시스템의 개발이 필요 시 되고 있다. 박테리아의 검출을 위하여 가장 많이 이용되는 기존의 유전자 진단방식인 중합효소연쇄반응은 샘플에서의 유전자 추출과 정제의 전처리 과정, 유전자 증폭을 위한 정확한 온도 조절, 크고 비싼 장비들이 필요하므로 현장에서의 빠른 진단을 위해 사용되기에는 많은 어려움을 가지고 있다. 이러한 문제점들을 해결하기 위하여 본 논문에서는 샘플 전처리 과정을 생략할 수 있는 시약과, 등온 증폭방법, 회전식 마이크로 플루이딕 기술을 융합하여 현장에서 빠르게 식중독 박테리아를 검출할 수 있는 회전식 유전자 진단 마이크로 디바이스를 개발하였다.
박테리아를 융해시키고 유전자의 추출을 가능하게 하는 시약과 $39 ^\circ C$에서 유전자 증폭을 일으키는 효소들의 조합으로 우유 속의 박테리아를 원스텝으로 증폭시켜 실시간 모니터링을 통하여 검출할 수 있었다. 개발된 마이크로 디바이스는 3개의 샘플을 동시에 테스트 할 수 있으며, 각각 주입된 샘플과 시약들은 회전력으로 동등하게 분배되며 4개의 마이크로 반응기를 만들어 총 12개의 반응을 한 디바이스 내에서 동시에 수행할 수 있었다. 각 반응기의 유전자 증폭 과정은 반응이 진행될수록 증가하는 형광신호를 이용하여 실시간으로 확인할 수 있었다. 이러한 마이크로 디바이스를 이용하여 30분 내에 우유 속에 존재하는 1개의 박테리아까지 검출할 수 있었으며, 다중검출을 위해 각각의 박테리아를 증폭시키는 특정한 효소들을 서로 다른 반응기에 건조시켜 놓음으로써 한가지 샘플 안에 들어있는 2종류 혹은 3 종류의 박테리아를 동시에 검출할 수 있었다.
본 연구에서 개발된 마이크로 디바이스는 다중 식중독 박테리아를 동시에 빠르고 정확하게 실시간으로 검출할 수 있는 소형화된 시스템으로 식중독 박테리아의 진단을 위해 현장에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
