Proteins require many additional chemistries beyond the natural 20 amino acids that have limited number of functional groups to perform their natural functions. Genetically encode adding an amino might enable the evolution of proteins and entire organisms with new or enhanced properties. In fact, we can make an unnatural amino acid with the steric and electronic characteristics and it is possible to introduce a probe function, PTM, metal chelator, Photoaffinity label or chemical moieties to the desired position in the proteins. This technology allows the production of a modifying or labeling protein and, probing the protein to study protein structure and function, and modulating the activity of the protein and was able to identifying of proteins. Single-molecule FRET can provide an ideal analytical method for understanding the structure and dynamics of molecules and interaction of biomolecules. Nonetheless, site-specific labeling of proteins with a pair of donor and acceptor dyes still remains a challenge. To solve this problem, we developed a general and facile method to the labeling position as specific proteins using incorporation of the two different amino acid (AlK.AcF) Therefore, using a newly evolved using Alkyl lysine-specific aminoacyl-tRNA synthetase / tRNA CA and p-acetylphenylalanyl-tRNA synthetase / tRNACUA, We were able to incorporation of AcF, AlK to 34 113 position of calmodulin, and then through the hydrazone formation and click reaction using the click , we could labeling the dye with a high efficiency. The utility of our approach was demonstrated by analyzing the conformational change of dual-labeled calmodulin using smFRET measurements. Therefore, our method will significantly increase the repertoire of proteins available for FRET study and expand our ability to explore more complicated molecular dynamics. In addition, we implemented bio-orthogonal reaction in mammalian cells through the incorporation of unnatural amino acids. Technique for labeling a protein in mammalian cells can be observed for localization of the protein, or the protein monitoring. So it will be able to provide an important clue to find the function of intracellular protein are not known in the existing and to establish an interaction between the proteins. strain-promoted alkyne-azide cycloaddition reaction is suitable for mammalian cell experiment. The reason is that there is no cell toxicity, have fast reaction rate and takes place in a mild condition. Using this reaction, we were successfully biosynthetic the tubulin protein as the site-specific labeling. The present labeling approach is devoid of major limitations in conventional cysteine-based labeling or GFP labeling. Therefore, it is expected that there may be more applicable to study protein which is involved in most biological processes, an important function.
단백질은 그들의 자연적 기능을 수행하기 위해 20가지 아미노산이 가진 제한된 기능기를 넘어 더 많은 추가적인 화학작용이 필요하다. 실제로 우리는 특정한 기능기를 가진 비 천연 아미노산을 만들 수 있으며 번역 후 변형, 메탈 킬레이터, 광친화성 표지등을 단백질의 특정 위치에 도입할 수 있다. 이러한 기술을 통해 변형된 단백질을 생산할 수 있고, 단백질 탐색을 통해 단백질 구조와 기능을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 단백질의 활성을 조절하고 규명 할 수 있게 되었다. 단분자수준 프렛 분석은 프랫 효율의 평균값만을 줄 수 있는 기존 앙상블 측정 방법과는 달리 분자의 여러가지 존재 상태를 구별하고, 각각의 분포 확률을 얻을 수 있기 때문에 생물 분자의 구조와 동력학, 분자간의 상호작용을 이해하는데 이상적인 분석 방법을 제공할 수 있다. 그럼에도 불구하고 위치 특이적으로 단백질에 전자 주개와 전자 받개 역할을 하는 염료를 붙이는 것은 여전히 도전과제로 남아있고, 이를 해결하기 위해 우리는 서로 다른 두 아미노산을 이용하여 위치 특이적으로 단백질을 표지 할 수 있는 일반적이고 획기적인 방법을 개발하였다. 우리는 새롭게 진화된 알카인 라이신 인식 티알엔에이 합성효소/티알엔에이 와 파라 아세틸 페닐알라닌 티 알엔에이 중합효소/티알엔이 를 사용하여 칼모듈린의 34, 113 위치에 파라 아세틸 페닐알라닌, 알카인라이신를 도입 시킬 수 있었고, 옥심 반응과 클릭 반응을 통해 높은 효율로 염료를 부착 시킬 수 있었다. 이렇게 만들어진 두가지 형광 염료로 표지된 칼모듈린을 이용하여 단분자 수준 프렛 분석 측정을 통해 리간드와 칼슘의 유무에 따른 구조적 변화를 성공적으로 관찰 하였다. 앞으로 우리의 기술은 프렛 연구에 이용될 단백질의 레퍼토리를 증가시킬 수 있을 뿐 아니라 더욱 더 복잡한 분자의 동력학 연구에도 활용될 수 있을 것으로 기대한다. 또한 우리는 비 천연 아미노산을 포함한 단백질을 동물세포에서 생산하였고, 생물체 내에서 교차 활성이 없는 반응을 통해 선택적으로 표지 시켰다. 살아있는 세포에서 세포의 이동, 형태, 그리고 생리학적 사건 등이 포함된 복잡하고 빠른 세포의 동력학를 연구하는 것은 생물학적 과정을 이해하는데 중요한 과정이다. 오늘날 형광 현미경을 통해 세포 소기관의 움직임뿐만 아니라, 생물분자들의 움직임 또한 관찰할 수 있고 이를 위해서는 체내에서 효율적으로 단백질을 표지 시키는 기술이 필요하다. 우리는 세포 독성이 없으며 높은 선택성, 빠른 반응속도를 가지는 SPAAC 반응을 통해 동물세포 내에서 튜뷸린 단백질에 위치특이적으로 표지 할 수 있었다. 우리가 동물세포에서 구현할 수 있었던 이 기술은 단백질의 분포 위치를 관찰하거나 단백질을 모니터링을 할 수 있기 때문에 세포내 단백질의 기능을 찾는데 매우 중요한 단서를 제공할 수 있으며 단백질 간의 상호작용 네트워크를 확립할 수 있다. 이렇게 본 연구에서 수행된 단백질 표지화 접근법은 시스테인을 기반으로 한 표지 기술과 형광단백질을 이용한 방법의 한계점을 보완할 수 있기에 앞으로 대부분의 생물학적 과정에 관여하고, 중요한 기능을 수행하는, 단백질 연구에 더 많이 응용될 수 있을 것이라 기대된다.
