Hearing loss was occurred due to the damage of hair cell and spiral ganglion neuron in inner ear. If hair cells were damaged, it couldn’t be regenerated. Therefore, many attempts have been tried to deliver steroids such as dexamethasone or gene for inner ear fundamental therapy. Intratympanic route has attracted a great deal of interest for local drug delivery, performed via the injection or perfusion of drugs into the middle ear and drug diffusion into the inner ear through the round window membrane (RWM). Especially, this local delivery using nanoparticle has several advantages, including high drug concentrations in inner ear fluids and the avoidance of undesirable systemic exposure. In chapter 2, three kinds of cell penetrating peptides (Penetratin, Tat, and Arg8) were examined as RWM penetration enhancers. From the their cellular uptake study in HEI-OC1 cells, Arg8 was selected as optimal CPP in inner ear cells. In chapter 3, Three types of carrier materials, PHEA-g-C18, PHEA-g-Arg8, and PHEA-g-C18-Arg8, were synthesized to examine the effects of oligoarginine and morphology of the synthesized carriers. Nile red (NR) was used as a fluorescent indicator as well as to model a hydrophobic drug. And the nanoparticles were investigated to determine whether the limitations of low drug transport levels across the round window membrane (RWM) and poor transport into inner ear target cells could be overcome. In chapter 4, the dexamethasone (Dex) loaded PHEA-g-C18-Arg8 nanoparticles were developed for the delivery of genes to draw the synergistic effect of dexamethasone and gene. The cationic PHEA-g-C18-Arg8 nanoparticles were self-assembled to create cationic micelles having a octadecylamine (C18) core cooperated with loaded Dex, and a Arg8 peptide shell for electrostatic complexation with genes (Cx 26 siRNA, GFP DNA, BDNF pDNA). Dex in PHEA-g-C18-Arg8/Dex nanoparticles would achieve the anti-inflammation effect, and enhance the gene expression as a carrier.
난청은 내이의 와우각 속 기저막에 있는 유모세포와 신경세포의 손상으로 발생한다. 유모세포는 한번 손상되면 회복 될 수 없기 때문에 이를 사전에 방지하거나 재생하기 위한 목적으로 덱사메타손과 같은 스테로이드제나 근본적인 난청의 치료를 위해서 유전자를 목표 부위에 전달하고자 하는 노력들이 시도되어 왔다. 고막내의 중이막을 통해 약물을 전달하는 방법인 고막내 전달방법이 각광받고 있으며, 이 전달 방법은 중이막인 정원창막을 통해 약물이 전달되는 방법으로 최근에는 나노파티클 약물전달 방법이 많이 시도되고 있다. 본 연구에서는 옥타데실아민이 결합된 폴리하이드록실아스팔트아미드를 기본으로 하는 양친성 고분자를 제조하여 나노파티클을 제조하였다. 이 나노파티클에 올리고아르기닌 펩타이드를 결합하여 고막내에 적용하여 정원창막의 투과와 유모세포 및 신경세포로의 이입효과를 관찰하고자 했다. 제 2장에서는, 내이 세포로의 이입율이 좋은 세포투과성 펩타이드를 선정하기 위해 로다민을 지표로 하는 Penetratin, Tat, 그리고 Arg8을 대표적인 세포투과성 펩타이드로 선정하여 HEI-OC1세포내로의 세포이입율을 비교실험 하였다. 그결과, 동일한 농도로 세포에 적용하였음에도 불구하고, Arg8이 Penetratin과 Tat에 비해 내이 세포내로의 높은 이입률이 확인되었고 응집현상 없이 세포핵 내에 고르게 분포함을 확인했다. 제 3장에서는, 폴리하이드록실 아스팔트아미드 기반의 생체적합성 고분자와 2장에서 선정된 Arg8 세포투과성 펩타이드를 토대로 하여 나노파티클의 형태와 사이즈에 따라서 세포투과와 이입효율 변화를 관찰하였다. 2장에서의 실험을 바탕으로 3장에서는 PHEA-g-C18, PHEA-g-Arg8 그리고 PHEA-g-C18-Arg8 나노파티클을 제조하여 특성분석을 하였고 이를 토대로 in vitro, ex vivo 그리고 in vivo 실험을 진행하였다. PHEA-g-C18과 PHEA-g-C18-Arg8 나노파티클을 비교실험 한 결과 in vitro, ex vivo그리고 in vivo 실험에서 PHEA-g-C18-Arg8의 HEI-OC1세포로의 높은 이입효율을 관찰 할 수 있었다. 이를 기반으로 PHEA-g-C18-Arg8 그룹의 동물실험을 진행한 결과 나노파티클이 정원창막을 통과하여 유모세포 및 신경세포에 다량 분포되어 있음을 확인했다. 또한, 나노파티클의 사이즈와 형태에 따라서도 이입 효율을 관찰하였는데 PHEA-g-Arg8의 친수성 겔 형태의 입자와 PHEA-g-C18-Arg8을 비교한 결과 원형의 나노사이즈를 지닌 PHEA-g-C18-Arg8 나노파티클 그룹에서 in vitro, ex vivo상에서 현저히 높은 이입률을 나타냈다. 이를 통해 세포와 조직간의 파티클의 이입현상은 나노파티클의 형태와 사이즈에 영향을 받음을 알 수 있었다. 이 연구에서는 약물 및 유전자 전달체로서의 활용을 위해 소수성 약물 대신 나일레드를 PHEA-g-C18-Arg8의 소수성 부분인 옥타데실아민(C18)에 포집하였고, 유전자 전달의 가능성을 확인하기 위해 지표유전자로서 DNA가 코딩된 그린형광단백질(GFP)을 수용액 상에서 PHEA-g-C18-Arg8의 표면의 양이온 전하를 띄는 Arg8과 이온결합하여 GFP의 발현을 동물실험을 통해 확인하였다. 그 결과, 나일레드와 GFP가 결합된 PHEA-g-C18-Arg8나노파티클이 중이에 있는 정원창막을 통과하여 내이에 위치한 신경세포와 유모세포에서 관찰되어 내이로의 약물 및 유전자 전달체로의 가능성을 확인했다. 제 4장에서는, 3장에서의 실험들을 바탕으로 하여 PHEA-g-C18-Arg8 나노파티클에 항염증 스테로이드제인 덱사메타손(Dex)을 모델약물로 나노파티클의 소수성 부분인 옥타데실아민에 담지하고, 유전자 발현의 기능성을 관찰하기 위해 코넥신 26 siRNA (Cx 26 siRNA) 와 뇌신경 생장인자(BDNF) DNA를 각각 RNA 모델과 DNA 모델로서 나노파티클의 표면에 이온결합으로 적용하여 유전자의 발현정도를 통해 PHEA-g-C18-Arg8의 유전자 전달체로의 가능성을 확인했다. 여기서 덱사메타손과 유전자를 함께 PHEA-g-C18-Arg8에 로딩하여 덱사메타손으로 인한 유전자 전달의 영향을 관찰했다. 첫째는, 덱사메타손의 세포내의 세포핵 기공확장 기능을 통해 덱사메타손이 있는 군에서 세포내로의 유전자 이입률이 증가했음을 확인했고, 둘째는 덱사메타손의 항염증 효과로 인해 염증발현 mRNA의 발현이 억제됨이 나타났다. 이를 통해 PHEA-g-C18-Arg8/Dex 나노파티클에 Cx 26 siRNA 또는 BDNF DNA를 파티클의 표면에 이온결합하여 현재 시판되고 있는 유전자 전달체인 $Lipofectamine^®$ 과 비교하여 그 기능성을 평가하였다. 그 결과, PHEA-g-C18-Arg8/Dex 나노파티클을 통한 Cx26 siRNA의 전달로 Cx 26 유전자가 24시간까지 Lipofectamine에 비해 발현이 억제되었다. 또한, 웨스턴블로팅 실험을 통해 난청치료의 유전자 치료제 후보인 BDNF DNA가 30시간까지 발현양이 증가함을 통해 PHEA-g-C18-Arg8은 약물 및 유전자전달체로서의 가능성이 예상되었다.
