Some methylotrophs were studied with their ability of poly-β-hydroxybutyrate production and extracellular polysaccharide production from methanol as a sole source of carbon. Methylobacterium organophilum NCIB 11278, a facultative methylotroph, originally isolated as a methane-utilizing bacterium, not only accumulates the poly-β-hydroxybutyrate, but also produces the extracellular polysaccharide on a minimum synthetic medium.
For the efficient production of the polysaccharide from Methylobacterium organophilum NCIB 11278, the effect of the medium components and culture conditions were studied in batch culture. The optimal concentrations of medium components for maximum polysaccharide production were as follows; Methanol, 0.5%(v/v); $(NH_4)_2SO_4$, 0.3g/l; $Na_2HPO_4$, 1.06g/l; $KH_2PO_4$, 0.65g/l; $MgSO_4$, 0.45g/l; and trace elements.
The optimal pH and temperature for polysaccharide production were 6-7 and $30\circ{C}$, respectively. This organism grew on 0.25%(v/v) methanol with a maximum specific growth rate of $0.28hr^{-1}$. Methanol concentration higher than 4.0%(v/v) was toxic. The maximum polysaccharide productivity (P/X) was obtained 0.42 g-polysaccharide/ g-DCW with 0.5% methanol in batch culture. The substrate (methanol) inhibition and toxicity in polysaccharide production were recovered by constant fed-batch culture which was carried out by a fixed feeding rate (1.0 ml/min) with methanol containing media. The production of polysaccharide was stimulated by deficiency of nutrients except carbon source. By constant fed-batch culture, the polysaccharide was produced to 0.95g together with 1.0g of dry cells, per liter of the culture broth. The maximal productivity on methanol was enhanced to more than twice times by constant fed-batch culture as compared with the batch culture. And the optimal C/N molar ratio of feeding liquid is 100.
현재까지 알려진 Methylotroph 중 일부는 유일한 탄소원인 Methanol로부터 다당류의 생성과 PHB(poly-β-hydroxybutyrate)의 축적에 관한 연구가 수행 되어 왔다. 본 실험에서는 facultative Methylotroph인 Methylobacterium organophilum NCIB 11278을 이용하여 최소배지에서의 효율적인 다당류 생산을 위한 배지조성을 확립하였으며 그 조성은 아래와 같다.
Methanol, 0.5%(v/v); (NH) SO ,0.3g/l; Na HPO ,l.06g/l; K HPO , 0.65g/l ; MgSO , 0.45g/l, and trace elements.
이러한 배지로부터 배양조건 중에 온도, pH, 그리고 Methanol 의 농도가 균체의 성장과 다당류의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 서로 다른 조건에서 회분식 배양 (Batch culture) 을 수행하였다. 다당류의 생산을 위해서는 발효 중에 배양액 내의 질소원이 결핍되어야만 다당류의 생산성이 증가한다는 점이 확인되었다. 배양액의 pH 는 균체의 성장 뿐 만 아니라 다당류의 생산성에 중요한 역할을 수행하며 중성 pH (6-7) 가 최적 조건임을 알 수 있었다. 한편 배양온도 역시 중요한 물리적 인자이며 온도의 상승과 더불어 미생물의 비성장속도는 점진적으로 증가하지만 다당류의 생산성에 30℃ 에서 가장 좋은 결과를 얻었다. Methanol의 초기 농도가 증가할수록 균체의 비성장속도가 감소하는 점으로부터 Methanol 의 자체 독성뿐만 아니라 기질 저해성이 크다는 사실을 알 수 있었으며, 이때 Methanol의 농도가 4.0% 이상일 때는 미생물의 성장이 완전히 저해되었다. 반면 다당류의 최대 생산성 (P/X) 은 Methanol 이 0.5% 일 때 0.42 g-polysaccharide / g-cell mass로써 가장 효율적인 조건임을 알 수 있었다.
이로부터 Methanol에 의한 저해 작용을 극복함과 더불어 발효조당 다당류의 생산성을 증가시키기 위해 연가식 배양(Fed-Batch Culture)를 수행하였다. 탄소원인 Methanol의 공급을 낮게 통제하고 질소원을 결핍시킴으로써 다당류의 생산성은 회분식 배양에 비해 약 3 배 가량의 증가를 보여 주었다. 또한 연가식 배양시 공급액(feeding liquid)의 C/N 비율(molar ratio)을 조절한 결과 다당류의 최대 생산성과 최대 비생성속도는 C/N 비율이 약 100일 때 얻을 수 있었다.
