Human chorionic gonadotropin(hCG) was further purified from crude hCG by Gel filtration (Sephadex G-150). α -and β -subunit were separated by treating 8M Urea and purified by using an ion exchange chromatography (DEAE-Sephadex A-25) and gel filtration (Sephadex G-75).
A two-site sandwich EIA for human chorionic gonadotropin employing monoclonal antiboides directed against α-and β-subunits is described. Monoclonal anti-hCG antibody and polyclonal rabbit anti β-hCG antibody were used for coating mocrotitration plates and monoclonal anti β-hCG antibody labelled with alkaline phosphatase was used as a tracer.
Monoclonal anti α-hCG, anti β-hCG antibody, and rabbit anti β-hCG antibody were purified by using whole hCG-affinity-chromatography. The purified Monoclonal antibodies were tested for reactivity with α-,β-anvd whole hCG by indirect ELISA. The monoclonal anti β -hCG antibody strongly reacted with β - and whole hCG, and had low reactivity with the α-subunit of hCG. The monoclonal anti α -hCG antibody reacted specifically with α-and whole hCG but hardly with β -hCG. Using the two wite EIA, the rabbit anti α-hCG antibody reacted with whole hCG but not with subunits of hCG.
A two site EIA is able to differentially detect hCG up to 5mIU/ml (1.7ng/ml) with a 'two-step' assay. The assay can be performed as a 'tow-step' assay or reduced to a 'one step' procedure with coincubation of a sample and conjugate. A two site EIA is able to perform the differential detection of whole-hCG in the presence of its subunits and other glycotropic hormones (hTSH, hFSH). This assay system showed some crossreactivity with hLH (7.8% for a 'two-step' assay and 13% for a 'one-step' assay).
인체 융모성 성선 자극 호르몬 (human chorionic gonadotropin;hCG) 은 태반의 영양 배엽 세포에서 분비되는 당단백질 호르몬으로서 두개의 subunits (α와 β)가 비공유 결합으로 결합되어 있다.
Sigma사에서 구입한 인체 융모성 성선 자극 호르몬을 Gel(Sephadex G-150)에 여과시켜 얻은 정제된 whole-hCG 를 8M 의 Urea로 처리하여 2개의 subunits를 이온교환 크로마토그라피를 이용하여 분리하였다. 두 번째 분획을 β-hCG 로 사용하였고, 첫 번째 분획을 다시 Gel(Sephadex G-75)에 여과시켜 두 번째 분획을 α-hCG로 사용하였다.
본 실험실에서는 α-hCG 와 β-hCG에 대한 단일클론항체를 이용하여 인체 융모성 성선자극 호르몬의 측정을 위한 샌드위치 효소 면역 측정법을 개발하였다.
β-hCG 에 대한 단일클론항체와 코끼의 항체로써 microtiter plates 를 coating 하였으며 w-hCG 만을 측정하기 위하여 α-hCG에 대한 단일클론항체 (C10c.14)에 alkaline phosphatase를 결합시켜 항체-효소 복합체를 만들었다. β-hCG에 대한 단일클론 항체 (Kw), α-hCG에 대한 단일클론항체 (C10c.14) 와 코끼의 항 β-hCG는 친화성 크로마토 그라피를 통하여 분리하였다. 분리한 항체는 whole-hCG 와 그 subunits 들과의 반응성을 간접적인 효소 면역측정법(Indirect ELISA) 으로 조사하여 보았을 때 단일클론 항 β-hCG(Kw) 는 β-hCG 와 whole-hCG에 강하게 반응하였으며 α-hCG와는 낮은 반응성을 보였고, 단일클론 항 α-hCG(C10c.14) 는 특이하게 α-hCG와 whole-hCG 에 반응하였으나 β-hCG 와 반응성은 무시할 정도로 낮았다. 샌드위치 효소면역 특정법을 이용하면 토끼의 항 β-hCG는 w-hCG와 반응하였으나 α-hCG와 β-hCG 와의 반응성은 무시할 정도였다. 본 실험에서 사용한 샌드위치 효소면역 측정법으로는 w-hCG를 최소 5mIU/ml(1.7 ng/ml) 까지 선별적으로 측정할 수 있었다. 이러한 측정법은 분석 시간을 단축시키기 위해 샘플과 항체-효소 접합체를 동시에 incubation 하는 1단계 과정으로도 수행할 수 있었다. 본 실험에서 사용한 샌드위치 효소면역 측정법으로는 hCG 의 subunits 와, 인체 여포 자극 호르몬, 인체 갑상선 자극호르몬과의 교차반응 없이 w-hCG를 선별적으로 측정할 수 있었으며 인체 황체화 호르몬에는 약간의 교차 반응을 보였다 (7.8% for a $\underline{two-step}$ assay and 13% for an $\underline{one-step}$ assay).
