The culminating events in eukaryotic lagging strand DNA synthesis include the removal of flaps by processing enzymes such as Dna2 and Fen1 and the subsequent sealing of resulting nicks by DNA ligase. In this study, we identified CDC9 (encoding DNA ligase I) as a multi-copy suppressor of two mutant alleles of Saccharomyces cerevisiae DNA2, the gene encoding a single-strand specific endonuclease that plays a critical role in Okazaki fragment maturation. We found that the catalytic activity of Cdc9 is not essential for suppressing the growth defect of the two dna2 mutant alleles while the elevated levels of Cdc9 could alleviate the requirements of Dna2. We also found that purified recombinant Cdc9 was able to stimulate in vitro endonuclease activities of both Rad27 (yeast Fen1) and Dna2, suggesting a certain mechanism by which Cdc9 could suppress the dna2 growth defects. Our data in vivo and in vitro suggest that, while Cdc9 participates directly in the maturation of lagging strand synthesis using its catalytic activity, it also contributes to Okazaki fragment maturation via its specific protein-protein interactions with Rad27 and Dna2, the two main endonucleases of the Okazaki fragment maturation. In vitro experiments with the various mutant versions of Cdc9 reveal the crucial role of N-terminal part of Cdc9, which has been known to contain the interacting site with PCNA and nuclear location signal, and they confirm again that the ligase activity of Cdc9 is not necessary for the interaction with Rad27 and Dna2.
생명체에게 있어서 유전물질의 복제와 보존은 매우 중요하고 이를 위해 여러 기작들이 진화되어 왔다. DNA 복제와 수선 기작 각각에는 여러 필수 단백질 인자들이 관여하고 있는데, 그 중 하나인 DNA ligase는 양쪽 기작 모두의 최종 단계에서 핵심적 역할을 맡는다. DNA 복제 과정 시 지체 가닥으로부터 주기적으로 합성되는 오카자키 단편 (Okazaki fragment) 들은 DNA 중합효소에 의해 5` -> 3` 방향으로 연장되면서 앞서 합성된 오카자키 단편의 5‘-end 부분이 가지 모양의 5’ flap구조로 바뀐다. 핵산가수분해효소인 Dna2 및 Fen1의 협력적인 작용으로 이들은 nick으로 다듬어지고, 그런 다음에 DNA ligase가 이들을 붙임으로 마무리 작업을 맺는다. DNA 수선 과정에서도 DNA ligase는 중요한데, 핵산가수분해효소와 수선용 DNA 중합효소의 활동 후 수선 마지막 단계에 DNA에 남겨진 nick이 DNA ligase에 의해 이어진다. 따라서 DNA ligase는 여러 DNA대사의 최종 단계의 마무리에 필수적인 효소이다.
DNA 복제와 수선에 관련된 다수의 단백질들은 출아효모 (Saccharomyces cerevisiae)와 그 이외에 여러 모델 생명체들을 통해 연구되어 왔었다. 출아효모는 두 개의 DNA ligase 유전자들을 갖고 있는 데, 하나는 인간 DNA ligase Ⅳ의 동종 단백질의 유전자인 DNL4으로써 Dnl4은 이중 가닥 끊김에 대한 비상동성 말단 연결 수리 과정에만 역할이 제한되어 있다. 그와 대조적으로, 다른 유전자인 CDC9은 인간 DNA ligase I의 동종 단백질이기도 한 다기능성 단백질에 대한 유전자이고, 출아 효소의 복제 및 수리 메커니즘 내에서 Cdc9은 위에서 언급된 역할들을 비롯한 여러 기능들을 맡고 있음이 보고 되어 왔다.
본 연구실에서는 helicase 활성이 결여된 dna2K1080E, 그리고 405개 아미노산의 N-말단 부분이 삭제된 dna2Δ405N 과 같은 DNA2의 돌연변이 균주들의 표현형을 억제하는 인자를 효모 유전체 라이브러리를 사용한 스크리닝을 통해 검색해 왔었다. 이 스크리닝 과정에서 MPH1, PSO2, VTS1, RMI11. CDC9, RPA1 등의 유전자들이 억제인자로 확인되었다. 이들 중 몇몇은 과다발현을 통한 유전적 분석으로 Dna2결함억제능력이 재차 확인되었고, 후에 in vitro 실험 등을 통한 생화학적 차원에서의 연구를 통해 Dna2와 이들 간의 상호 작용이 자세히 연구하여 보고하였다.
CDC9은 dna2Δ405N allele을 갖는 YJA2 균주에서의 효모 유전체 라이브러리 스크리닝을 통해 최초로 확인되었고, 그런 다음 DNA helicase defective dna2K1080E 의 결함을 억제할 수 있는 지 알아보는 실험이 수행되었다. 그 결과 VTS1이나 MPH1처럼, CDC9의 과다발현은 위에서 언급된 두 dna2 돌연변이 균주들의 성장 결함을 모두 억제할 수 있었다. 지금까지 보고 된 적이 없는 상호 작용을 제시하는 이 실험 결과를 시발점으로 해서 본 연구에서는 출아효모 내 오카자키 단편들의 효율적 제거와 연관된 Dna2/Fen1과 Cdc9 간 상호작용의 기작에 대한 분석을 중점적으로 수행했다. 우리는 Cdc9의 ligase 기능이 Dna2결함억제능력에 필수적이지 않다는 점을 발견했고 이 결과는 Cdc9의 N 말단들의 in vivo 발현만으로 억제 효과가 관찰된다는 점에 의해 더욱 더 뒷받침되었다.
in vivo에서의 DNA ligase I의 과다발현에 의한 Dna2 결함억제능력에 대한 가장 간단한 설명은 Dna2 또는 Rad27의 endonuclease 활성을 증가시켜 작용하는 것이다. 우리는 in vitro endonuclease assay을 통해 정제된 재조합 Cdc9 단백질이 Rad27과 Dna2의 핵산가수분해 활동을 촉진한다는 것을 확인했을 뿐만 아니라, ligase 능력이 제거된 cdc9 돌연변이 단백질들도 마찬가지로 Rad27 의 핵산가수분해 활동을 촉진한다는 것도 관찰하였다. 자연형 Cdc9과 달리 이들 돌연변이 단백질들 대부분은 Rad27에 의해 생성되는 nick들을 봉합하지 못하지만, 자연형 Cdc9 과 동일한 정도로 Rad27를 활성화 시키고, 이는 Cdc9에 ligase 기능 이외에 다른 부가적인 기능들이 있음을 시사한다.
Cdc9의 N-말단 부분과 다른 DNA 복제/수선 단백질들 간의 상호 작용들은 이미 여러 연구들을 통해 보고되어 왔다. Cdc9은 N-말단 38-45 아미노산 영역에는 PCNA와 물리적 결합이 가능한 잘 보존된 PIP box를 갖고 있고, 따라서 간접적으로 PCNA를 통한 단백질-단백질 상호작용으로 Dna2의 결함의 억제가 일어날 수 있다. Cdc9의 44번과 45번 페닐알라닌을 알라닌으로 치환하여 또 다른 cdc9 돌연변이 유전자를 만든 다음 이를 YJA2 균주에 발현하여 Dna2결함억제능력을 조사한 결과, cdc9FFAA 는 CDC9 과 달리 Dna2 결함억제능력을 상실했다. 반면에 재조합 cdc9FFAA 단백질은 자연형 Cdc9처럼 ligase 능력을 갖고 있는 가운데 Rad27의 핵산가수분해활동을 in vitro 상에서 촉진할 수 있었다. 이는 PCNA와 Cdc9 간의 상호작용이 in vivo 상에서의 Dna2 결함억제에 필수적임을 시사한다.
본 실험에서 우리는 Rad27/Dna2에 대한 Cdc9의 촉진 효과가 Dna2 결함 억제 기능에 중요하다는 결론을 내린 동시에 Cdc9의 주 기능인 ligase activity보다는 PIP box 가 더 중요함을 확인하였다. 우리의 실험 결과는 Cdc9이 단순히 오카자키 조각 제거 과정을 마무리 하는 단백질이 아님을 보여주는 가운데, 여러 대비 기작들에 의해 복잡하게 뒷받침되는 것으로 알려져 온 오카자키 조작 제거 과정에 대한 또 다른 흥미로운 관점을 제시한다. 본 실험의 최종 결론을 고려해 볼 때 Cdc9의 촉진 효과에 관련되어 있을 다른 상호작용들의 가능성에 대한 연구들이 요구될뿐더러, CDC9의 과다 발현이 Dna2 결함억제를 하면서 야기할 수도 있는 유전체 불안정성의 유무여부를 확인하는 연구도 후에 실행되어야 할 것이다.
