Over the decades, chemotherapy has been mainly applied for treatment of various diseases. Despite of strong potency, chemical drug has often led to severe systemic toxicity in patients. The side effects are closely related with off-target effect of chemicals. To address the issue, immunoglobulin G (IgG) has been considered as an emerging class of therapeutics for targeted therapy due to its remarkable target specificity with high affinity. However, the therapeutic antibody has critical drawbacks as expensive production cost, poor cell penetration efficiency and low biophysical stability that are caused by complex expression and purification process, large molecular size and multimeric conformation. Hence, considerable effort has been made to develop the alternatives, and a variety of protein scaffolds have been reported including Affibody, DARPin, Nanobody and Repebody with significantly improved properties (stability, solubility and easy of engineering). Thus, non antibody protein therapeutics can hold great promise for being developed as the next generation of targeted therapeutics in treatment of various diseases.
Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine that regulates immune responses for host defense and tumorigenic process. Upregulation of IL-6 is known to constitutively phosphorylate signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), leading to activation of multiple oncogene pathways and inflammatory cascade. Here, we present the development of a high-affinity protein binder, termed repebody, which effectively suppresses non-small cell lung cancer in vivo by blocking the IL-6/STAT3 signaling. We selected a repebody that prevents human IL-6 (hIL-6) from binding to its receptor by a competitive immunoassay, and modulated its binding affinity for hIL-6 up to a picomolar range by a modular approach that mimics the combinatorial assembly of diverse modules to form antigen-specific receptors in nature. The resulting repebody was highly specific for hIL-6, effectively inhibiting the STAT3 phosphorylation in a dose- and binding affinity-response manner in vitro. The repebody was shown to have a remarkable suppression effect on the growth of tumors and STAT3 phosphorylation in xenograft mice with non-small cell lung cancer by blocking the hIL-6/STAT3 signaling. Structural analysis of the repebody and IL-6 complex revealed that the tepebody binds the site 2a of hIL-6, overlapping a number of epitope residues at site 2a with gp130, and consequently causes a steric hindrance to the formation of IL-6/IL-6R$\alpha$ complex. Our results suggest that high affinity repebody targeting the IL-6/STAT3 pathway can be developed as therapeutics for non-small cell lung cancer.
A targeted therapy using drug conjugates has attracted much attention, but efficient and site-specific drug conjugation methods have yet to be developed for enhance therapeutic efficacy. Here, we present a robust and site-selective approach to drug conjugation by enzymatic lipidation. Our approach comprises insertion of the CaaX sequence at the C-terminal end of a protein binder, prenylated using farnesyltransferase (FTase), followed by drug conjugation through oxime-forming reaction. We used monomethyl auristatin F (MMAF) and EGFR specific repebody (rEgH9) as an antitumor agent and protein binder, respectively. Our chemoenzymatic method enabled precisely controlled synthesis of drug conjugates with high yield (>95%) and a uniform drug-to repebody ratio (DRR) of 1.0 under mild conditions ($30^\circ C$, pH 7.4). The utility of our approach was demonstrated by showing a potent and selective cytotoxicity ($EC_{50}$ of 72 pM in HCC827 cells) and a remarkable anti-tumor activity of repebody-drug conjugates (RDCs) with negligible off-target effects in xenograft mice model. The present approach can be widely used for site-specific conjugation of a drug for a targeted therapy in a highly efficient and homogeneous manner.
In this thesis, I have been successfully developed novel protein therapeutics using repebody engineering technology. The therapeutic protein candidates could expand the therapeutic market beyond the existing one and might result in creating new biological and medical industries. As mentioned above, the most important aspect is that as the RDCs are able to treat diseases which exhibit resistance or low potency against conventional therapies, it could make significant contributions to human health.
단백질 치료제는 기존의 화학제제와는 달리 높은 표적 특이성으로 인해, 부작용이 적고 높은 치료 효과를 보임으로써 많은 생명공학회사와 다국적 제약기업에서 집중적으로 개발하고 있다. 실제 임상에서도 많은 치료용 단백질들이 탁월한 효능을 보여 블록버스터로 시장에서 높은 성장세를 보이고 있다. 따라서, 국내에서도 세계 시장 진출을 위해서 시장에 나와 있는 성공적인 치료제에 버금가는 수준의 우수한 단백질 신약 개발이 절실하게 요구되고 있다. 하지만, 국내외에서 항체를 바탕으로 한 신약 개발에 많은 투자를 하고 있음에도 특허에 따른 선점기술로 인해 높은 시장 진입장벽을 극복하기에 어려움을 겪고 있다. 이로 인해, 바이오 시밀러 개발에 집중되고 있는 실정이나 오리지날 의약품 혹인 다른 바이오 시밀러와 치열한 경쟁을 해야한다는 복제약의 내재적 단점을 지니고 있다. 이러한 단점들을 극복하고자, 항체를 대체할 수 있는 비항체 골격 단백질을 이용한 치료용 단백질 개발이 활발하게 수행되고 있다.
본 연구는 신규 인공 항체 골격인 리피바디를 이용하여, 암 유발 인자인 인터루킨-6 에 특이적으로 강한 결합력을 갖는 비소 세포 폐암 치료제 후보의 개발에 관한 것이다. 이를 위해, 우선 파지 디스플레이를 위한 파지미드를 설계하였으며, 파지 표면에 리피바디를 발현하기 위한 조건을 확립하였다. 리피바디가 반복되는 모듈 구조임을 착안하여, 효과적으로 표적 단백질에 대한 결합력을 증대시킬 수 있는 모듈 기반 친화력 증대 기술을 개발하였다. 개발된 치료제 후보는 세포 및 동물 실험을 통해 낮은 면역원성과 비 소세포 폐암의 증식을 탁월하게 억제함을 확인하였다. 또한, 인터루킨-6 와의 복합체 구조를 밝혀 리피바디가 인터루킨-6 의 생물학적 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 작용기작을 규명하여 치료제 개발 가능성을 입증하였다. 현재 비 소세포 폐암 동물을 대상으로 임상 진입을 위한 전 임상 실험을 수행하고 있으며, 향후 임상 시험을 통해 안정성 및 치료 효능을 입증하여 단백질 신약으로 개발 할 계획이다.
또 다른 연구로는 상피세포 성장인자 수용체에 높은 특이성과 결합력을 갖는 리피바디를 이용하여, 리피바디-약물 복합체를 개발하는 것에 관한 것이다. 항암제를 비롯한 대다수의 화학 의약품은 표적에 대한 특이성이 없어, 일반 조직에도 높은 독성을 유발하는 부작용이 자주 관찰된다. 이를 극복하고자, 항체에 약물을 결합시킨 항체-약물 복합체 기술이 개발되었다. 높은 표적능과 전달능으로 인해 넓은 치료범위의 확보가 가능해, 기존의 의약품을 뛰어넘는 차세대 치료제로 각광 받고 있다. 하지만, 항체의 큰 분자량으로 인한 낮은 조직 투과력을 가지고 있다. 본인은 이를 해결하고자, 고 효능의 약물을 리피바디에 위치 특이적으로 결합하였다. 기존의 무작위적인 약물 결합 방식은 불균일한 항체-약물 복합체를 합성하여, 약물학적 특성을 저해하여 임상적 치료 효과를 예측할 수 없게 만든다. 이를 위해, 효소 반응과 화학 선택적인 결합 방식이 융합된 새로운 화학 효소적 방법을 개발하여 상동성이 매우 높은 리피바디-약물 복합체를 효과적으로 개발하였다. 리피바디-약물 복합체는 세포 실험을 통해 탁월한 선택적 세포 사멸을 유도함과, 동물 실험에서는 유의미한 전신 독성 없이 암의 성장을 효과적으로 저해함을 확인하였다.
본인은 해당 연구를 통해 인공항체 골격인 리피바디가 기존 항체를 대체하여 단백질 신약 개발에 이용될 수 있다는 것을 확인하였고, 향후 국내의 단백질 신약 및 생명공학 산업 발전에 크게 기여할 것으로 기대하고 있다.
