Gastric cancer has one of the highest cancer mortality rates worldwide, in large part owing to difficulties related to the early-stage detection of this type of cancer. We developed a comprehensive glycomic approach involving an immunoaffinity analysis, lectin blotting, and advanced MS techniques with regard to the discovery of potential gastric cancer biomarkers. Lectin blotting was initially used to identify a target glycoprotein that displayed aberrant glycosylation during cancer development. Of the major serum glycoproteins, haptoglobin which is identified by in-gel digestion and an MS analysis showed the most notable changes in lectin-binding affinity and was therefore selected as a target for subsequent analysis.
We purified haptoglobin from 16 serum samples consisting of gastric cancer patients (n=10) and control subjects (n=6) by immunoaffinity. N-glycans were directly released from haptoglobin using PNGaseF and were analyzed by MALDI-MS and LC-MS to obtain quantitative and structural information. An ANOVA statistical analysis was conducted to identify potential biomarkers for gastric cancer cases. In general, increased levels of antennary branching with fucosyl residues, and decreased levels of high mannose-type structures were observed in gastric cancer patients compared with controls. Fucosylated complex-type glycan Hex6HexNAc5Fuc1, 6510, and fucosylated complex-type glycan Hex6HexNAc5Fuc1NeuAc1, 6511, of Hp were found as fucosylated biomarker candidates with high AUC values (0.97, 0.98) between normal and cancer patients. A structural analysis by LC/MS/MS showed that the fucosylated N-glycans from patient haptoglobin displayed primarily antennary fucosylation, which can be categorized as Lex or sialyl-$Le^x$ type structures.
To analyze haptoglobin glycosylation in a site-specific manner, a targeted glycoproteomics approach was developed and applied to serum from gastric cancer patients. Haptoglobin was subjected to glyco-analytical multispecific proteolysis (glyco-AMP) in order to generate site-specific glycopeptides. Glycopeptides were identified and quantified by structure-specific porous graphitized carbon nano-LC/MS and -LC/MS/MS. From haptoglobin’s four glycosylation sites, a total of 96 glycopeptides, each corresponding to a unique glycan/glycosite pairing, were tracked and quantified across all cancer and control samples. Differences in abundance levels between cancer and control samples were marked by particularly high magnitudes, e.g., fucosylated complex-type glycans at Asn-241 increased in abundance by nearly ten-fold during gastric cancer. Glycan/glycosite pairings were screened for their suitability as potential biomarkers. Two glycan/glycosite pairings (Hex7HexNAc6Fuc1 at Asn-241 and Hex6HexNAc5Fuc1NeuAc1 at Asn-241) exhibited exceptionally high control-to-cancer fold changes along with ROC curve areas of 1.0, indicating perfect discrimination between the controls and gastric cancer cases (including both early- and late-stage patients). This comprehensive glycomic and targeted glycoproteomics approach using immunoaffinity, lectin blotting, and an advanced MS analysis may facilitate effective gastric cancer screening for the early diagnosis of gastric cancer.
위암은 전 세계적으로 높은 사망 원인 중의 하나로, 다른 암에 비하여 사망률이 높은 이유는 조기 진단이 어렵기 때문이다. 우리는 면역친화법 (immunoaffinity), 렉틴블랏팅 (lectin blotting) 그리고 질량분석법 (mass-spectrometry) 기술 등의 포괄적인 글라이코믹스 (glycomics) 접근을 이용한 위암 당바이오마커 (glycan biomarker)의 발견 방법을 개발하였다. 렉틴블랏팅(Lectin blotting)은 암 발생 과정 중에 타겟 단백질의 비정상적인 당사슬화(glycosylation)을 알아보기 위해 사용되었다. 혈청(Serum) 내에 존재하는 주요 당 단백질중의 하나인 햅토글로빈(haptoglobin)이 인젤분해법(in-gel digestion)을 통한 질량분석(mass-spectrometry)을 통해 주목할 만한 렉틴에 친화적인 결합을 가지는 단백질로 확인됨에 따라, 다음 분석을 위한 타겟 당단백질로 선정하였다.
우선, 햅토글로빈 항체를 이용한 면역친화법(immunoaffinity)를 이용해 위암 환자(n=10)와 대조군(n=6)의 총 혈청16 샘플을 정제하였으며, N-당사슬 분해효소인 PNGaseF를 이용해 햅토글로빈의 N당사슬을 추출하였으며, 말디질량분석(MALDI-MS)와 엘씨질량분석(LC-MS)을 통해 구조 분석과 함께 정량적인 분석을 수행하였다. 또한 통계적인 분석(ANOVA)을 통해, 정상인과는 다른 위암에서의 변화하는 당바이오마커를 찾아내고자 하였다. 일반적으로, 대조군과 비교하여 위암 환자에서는 안테나브랜칭 (antennary branching)이 증가하였고 브랜칭 증가에 따른 퓨코실화(fucosylation) 증가와, 고만노즈 타입구조(high mannose-type structure)는 감소하는 경향성을 보였다. 특히, 햅토글로빈의 푸코 실화 복합 형 당쇄 Hex6HexNAc5Fuc1 (Fucosylated complex-type glycan Hex6HexNAc5Fuc1, 6510) 및 푸코 실화 복합 형 당쇄 Hex6HexNAc5Fuc1NeuAc1 (fucosylated complex-type glycan Hex6HexNAc5Fuc1NeuAc1, 6511)은 정상 및 암 환자 사이에서 각각 높은 AUC (0.97, 0.98)로 구분됨에 따라 가장 진단 확률이 높은 당바이오마커로 보인다. 더 나아가 엘씨메스메스 (LC/MS/MS)를 이용한 구조 분석을 통해, 위암 환자의 햅토글로빈 중 과당화 N-당사슬(fucosylated N-glycan)은 주로 루이스X구조(Lex) 나 사이알루이스X 구조(sialyl-Lex)라고 일컬어지는 안테나로 이어진 퓨코실화(antennary fucosylation)의 형태를 보이는 것으로 나타났다.
또한, 위암 환자의 혈청 내에 존재하는 햅토글로빈의 위치 특이적인(site-specific) 당사슬화(glycosylation) 분석을 위하여, 타겟 글라이코프로테오믹스(targeted glycoproteomics) 기법을 개발하고 적용하였다. 환자(n=10)과 대조군 (n=15)의 총 25샘플의 햅토글로빈을 프로네이즈(pronase)처리를 통한 글라이코 멀티특이적단백질분해화 (glyco-multispecific proteolysis, glyco-AMP) 처리를 통해 위치 특이적인 당펩타이드(glycopeptides)를 생성하였고, 나노엘씨메스(nano-LC/MS) 그리고 엘씨메스메스(-LC/MS/MS)를 이용하여 구조를 지도화(mapping) 분석하였다. 햅토글로빈의 4군데 당사슬 사이트(glycosylation sites) 각각은 독특한 당/당사이트(glycan/glycosit)e 짝을 가지고 있다는 점을 이용하여, 총 96개 종류의 당펩타이드 (glycopeptides) 중 위암 환자와 대조군의 샘플 내 양의 많고 적음에 따라 비교하였다. Glycan/glycosite 짝을 이용해, 특히 두 개의 당/당사이트(glycan/glycosite) 짝인Hex7HexNAc6Fuc1 at Asn-241 과Hex6HexNAc5Fuc1NeuAc1 at Asn-241이 대조군에 비하여 암 환자에서 특별히 양이 높게 나타남을 확인하였다. ROC curve의 면적도 1.0이었는데, 이는 암환자 (초기와 말기 암환자 포함)와 대조군을 완벽하게 구별할 수 있다는 의미이다. 위와 같은 연구 결과는 위암환자 유래 햅토글로빈의 비정상적인 당구조를 활용한 새로운 위암진단 청사진을 제시하였다. 또한 면역친화법(immunoaffinity), 렉틴블랏팅(lectin blotting) 그리고 진보된 질량분석법(advanced mass spectrometry)을 포괄적으로 이용하는, 글라이코믹스(glycomics)와 타겟글라이코프로테오믹스 (targeted glycoproteomics) 방법은 위암을 포함한 다른 질병의 당바이오마커 발굴 연구 및 진단기술 개발에도 유용하게 활용될 것으로 기대한다.
