The ssrS transcription unit interestingly can produce an RNA product, 6S RNA, as well as a protein product, YgfA. The ssrS-encoded 6S RNA is an abundant noncoding RNA that binds to $\sigma ^{70}$ -RNA polymerase and regulates expression at a subset of promoters in Escherichia coli. It is transcribed from two tandem promoters, ssrS P1 ($\sigma ^{70}$) and ssrS P2 ($\sigma ^{70/S}$). In the first part of the thesis, regulation of transcription from two ssrS promoters for 6S RNA biogenesis was examined. Both P1 and P2 were growth phase-dependently regulated. Depletion of 6S RNA had no effect on growth-phase-dependent transcription from either promoter, whereas overexpression of 6S RNA increased P1 transcription and decreased P2 transcription, suggesting that transcription from P1 and P2 is subject to feedback activation and feedback inhibition, respectively. This feedback regulation disappeared in Δfis strains, supporting involvement of Fis in this process. The differential feedback regulation may provide a means for maintaining appropriate cellular concentrations of 6S RNA.
YgfA, also called as Fau, is an uncharacterized protein that belongs to the 5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase family. It is known that the ygfA expression may be related to persister cell formation, which contributes to the antibiotic resistance of bacterial biofilm. The ygfA mRNA co-transcribed with 6S RNA from two ssrS promoters can be prematurely terminated by action of Rho factor at near site +279 (named $t_1$ in this thesis), relative to the 5’ end of 6S RNA. This transcription termination site, named $t_1$ in this thesis, is located within the ygfA open reading frame (ORF). Therefore, ygfA expression can be regulated by two ssrS promoters as well as Rho-dependent termination that occurs at $t_1$. In the second part of thesis, a pBR322-based E. coli genomic library was screened to identify factors that could affect the $t_1$ termination. Rof as a protein repressing the t1 termination was identified in this screening. Rof is known to modulate the activity of Rho factor by directly interacting with it. The increase of ygfA mRNA levels was found when Rof was overexpressed because Rof could inhibit termination at $t_1$. However, deletion experiments showed that there is an extra Rho-dependent termination site upstream of $t_1$ between +185 and +238. This site, named $t_2$, was more sensitive to Rof than $t_1$, suggesting that termination at $t_2$ requires lower concentration of Rho. This was further supported by the result that overexpression of Rho increased termination at $t_1$ more efficiently than at $t_2$. Therefore, this result showed that, besides transcriptional regulation by P1 and P2, both Rho and Rof function differentially at $t_1$ and $t_2$ depending on their cellular levels so that ygfA gene expression can be sophisticatedly controlled. Furthermore, this study suggests that Rho and Rof can orchestrate gene expression through regulating transcription termination according to their cellular levels.
ssrS 전사 단위는 6S RNA와 YgfA 단백질을 생산할 수 있다. 6S RNA는 ssrS 유전자에서 합성된 풍부한 양의 비암호화 RNA이다. 184개의 염기서열을 가진 6S RNA는 대장균의 고정 성장단계에서 $\sigma ^{70}$ RNA 중합효소와 결합하여, $\sigma ^{70}$ 의존성 전사를 억제하며, 결과적으로 $\sigma ^S$ 의존성 전사를 활성화시킨다. 주변 환경변화에 맞춰 유전자의 전사를 조절하는 6S RNA는 세포 내에서 정밀하게 조절되어야 한다. 이러한 6S RNA의 생합성은 ssrS P1과 ssrS P2의 두 직렬 프로모터에서 시작되며, Rho 단백질에 의해 종결된다. $\sigma ^{70}$ 의존성을 가지는 ssrS P1 프로모터는 6S RNA의 5’ 말단에 여분의 9개 염기서열을 가진 짧은 형태의 P1 전구체를, $\sigma ^{70/S}$ 의존성을 가지는 ssrS P2 프로모터는 여분의 224개 염기서열을 가진 긴 형태의 P2 전구체를 합성한다. 합성된 전구체는 exonucleases와 RNase E/G에 의한 처리과정을 거쳐 기능성을 가진 성숙한 6S RNA가 된다. 6S RNA의 발현양은 두 직렬 프로모터의 활성과 P1 및 P2 전구체 처리과정의 효율성을 통해 조절될 수 있다.
본 연구는 두 직렬 프로모터 ssrS P1과 ssrS P2가 6S RNA 생합성에 미치는 영향에 관해 연구하였다. 연구의 첫 단계로서 세포의 성장단계 동안 각 프로모터의 활성 조절과 6S RNA가 여기에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 그 결과, 두 직렬 프로모터의 활성은 성장단계 의존적으로 조절되었다. 기하급수적 성장단계에서 P1은 P2보다 2~3배 정도 큰 활성을 가지며, P1은 기하급수적 성장단계에서, P2는 초반 고정성장 단계에서 최대 활성을 나타내었다. 최대 활성 시점을 지나면 P1 활성은 급격하게 감소하는 반면, P2 활성은 약간 감소하여 고정 성장단계에서 동일한 프로모터 활성을 갖게 된다. 6S RNA의 결실은 이와 같은 성장단계 의존적 조절에 영향을 미치지 않았다. IPTG에 의해 P1 및 P2 전구체를 과발현시키는 벡터를 제작하여 6S RNA를 과발현시킬 수 있는 시스템을 구축하였다. 이 벡터를 이용한 노던 블랏을 통해 P1과 P2 전구체 모두 동등하게 6S RNA 생합성에 기여하는 것을 확인하였다. IPTG에 의해 과발현된 6S RNA는 고정 성장단계에서 P1 활성을 증가시키는 반면, P2 활성을 감소시켰다. 이러한 결과는 6S RNA 과발현이 피드백 과정을 통해 P1 전사를 활성화시키고 P2 전사를 억제한다는 것을 보여준다. fis 결실 균주에서 6S RNA 과발현에 의한 두 직렬 프로모터의 피드백 조절은 사라졌으며, 이것은 6S RNA 과발현에 의한 두 직렬 프로모터의 전사 조절은 Fis 단백질과 관련이 있다는 것을 보여준다. 본 연구를 통해 세포 내의 6S RNA 농도는 과발현된 6S RNA에 의한 ssrS P1 및 P2 프로모터 전사의 피드백 조절을 통해 적절하게 유지된다는 것을 알 수 있다.
ssrS 전사 단위에서 생산되는 두 번째 유전자인 ygfA는 folatecyclo-ligase family에 속하는 특성화되지 않은 단백질로서 최근 Fau라고 명명되었다. 기존의 연구 결과는 ygfA의 발현양과 persister 세포 및 생물막 형성의 관련성을 보여준다. 6S RNA와 함께 전사되는 ygfA는 ssrS의 두 직렬 프로모터와 6S RNA 5’ 말단에서 +279에 위치한 Rho 의존적 종결 ($t_1$)에 의해 조절될 수 있다.
본 연구는 기존에 알려지지 않은 ygfA의 전사 조절 과정을 밝히기 위해 수행되었다. 연구의 첫 단계로서 $t_1$ 의 조절인자를 찾기 위해 Escherichia coli 게놈 라이브러리를 이용하여 $t_1$ 을 포함한 LacZ 융합 균주를 스크리닝하였다. 이 스크리닝 시스템을 통해 ygfA의 전사를 조절할 수 있는 Rho 의존적 종결의 항종결자인 Rof 단백질을 찾았다. Rof 단백질은 다른 보조인자 없이 Rho 단백질과 직접적으로 결합하여 Rho 단백질의 활성을 조절한다고 알려져 있다. 예상한 바와 같이 $t_1$ 을 포함한 LacZ 융합 균주의 LacZ 활성과 ygfA의 mRNA 발현양은 Rof 단백질의 과발현에 의해 증가하였다. 순차적 삭제 LacZ 융합 균주를 이용한 실험은 이전 논문에서 예측된 $t_1$ 과는 다른 ssrS+185~+238 영역에 존재하는 Rho 의존적 종결 부위 ($t_2$)를 보여주었다. IPTG 농도에 의한 Rof 단백질의 발현양 조절을 통해, $t_2$ 를 포함한 LacZ 융합 균주의 LacZ 활성은 $10^{-3}$ mM IPTG의 낮은 농도에서 증가하며, $t_1$ 을 포함한 LacZ 융합 균주의 LacZ 활성은 비교적 높은 $10^{-2}$ mM IPTG의 농도에서 증가하는 것을 관찰하였다. 이로부터 $t_2$ 의 종결은 $t_1$ 의 종결보다 낮은 농도의 Rho 단백질을 필요로 한다는 것을 알 수 있다. 이러한 사실은 Rof 결실 균주 및 Rho 과발현 실험을 통해 뒷받침될 수 있다. 결론적으로 ygfA 유전자 발현은 ssrS P1 및 P2 프로모터에 의한 전사 조절 이외에, $t_1$ 과 $t_2$ 에 대한 Rho와 Rof 단백질의 발현양에 따른 기능성 조절을 통해 제어된다는 것을 알 수 있다. 나아가 본 연구는 Rho와 Rof 단백질의 발현양에 따른 전사 종결의 조절을 통해 세포 내의 유전자 발현을 정밀하게 조절할 수 있다는 가능성을 뒷받침한다.
