The use of photodynamic therapy (PDT) at malignant and premalignant lesions has been on the increase. However, PDT is ineffective to treat metastatic and large size tumors due to delivery limitation of light itself. To overcome these problems, we introduced the PDT using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) because bioluminescence can activate the photosensitizers at disease lesions that light cannot penetrate owing to enzyme-substrate reaction. Emission wavelength of coelenterazine which is substrate of RLuc8 does not matched with excitation wavelength of second generation photosensitizer such as chlorin e6. So, 655nm quantum dots were conjugated with RLuc8 using BRET. After coelen-terazine administration, quantum dots conjugated with RLuc8 emit the specific overlapped wavelength light with absorption wavelength of chlorin e6. BRET PDT generated similar amounts of reactive oxygen species compared to conventional PDT and induced significant cytotoxicity in vitro experiments. And degree of cytotoxicity in BRET PDT was similar that of conventional PDT. In spite of tiny light of bioluminescence, significant cytotoxicity in BRET PDT is supposed to energy transfer between photosensitizer inside cell membrane and quantum dots conjugated with RLuc8 attached at cell membrane. In addition, reactive oxygen species generated during BRET PDT at cell membrane induce lipid peroxidation. In vivo experiments, BRET PDT group had tendency to inhibit growth of tumor compared to control group. In addition, there were significant apoptotic lesions and decreased tumor vessels inside the tumors in immunofluorescence assay. Furthermore, popliteal lymph node where conventional cannot delivered were treated using BRET PDT at footpad tumor injec-tion model. As treating popliteal LN which is moving route of tumors, lung metastasis was decreased after BRET PDT compared to control. In conclusion, BRET PDT may be novel method to overcome the limitations of conventional PDT and to prevent distant metastasis. BRET phenomenon will be applied other applications such as optogenetics.
광역동 치료는 빛과 광감각제라는 화학물질의 조합을 이용하여 병을 치료하는 방법이다. 광역동 치료는 광감각제를 활성화시킬 수 있는 특정 파장의 빛을 조사하는 경우 광감각제가 활성화되어 조직내의 산소와 반응하여 활성산소를 만들게 되고, 이 활성 산소가 세포독성을 유발하여 종양을 치료하게 된다. 광역동 치료는 여드름 치료 등에 사용하는 미용 목적이나, 황반 변성 같은 망막 질환에서 사용된다. 또한 바렛 식도 같은 전암성 병변에서도 수술 없이도 치료가 가능하여, 식도 수술 후의 합병증을 피할 수 있다. 이 외에도 기관지암, 담도암, 피부암, 자궁경부암처럼 직접 빛을 조사할 수 있거나, 내시경 등을 통해서 접근이 가능한 부위에서만 치료가 가능하다. 빛을 조직 내를 통과하면서 산란과 흡수 등을 거치면서 깊은 영역까지 빛을 전달할 수 없기 때문에 종양의 크기가 크거나, 전이에 있어서는 효과가 떨어진다. 이런 이유로 항암치료에 비해서 부작용도 적고, 약제 내성도 발생하지 않은 장점을 가지고 있음에도 불구하고, 암 치료에 있어서 제한적으로 사용되고 있다.
이를 극복하기 위해서 생물 발광을 도입한 새로운 방식의 광역동 치료를 시도하였다. 생물 발광은 반딧불이나, 산호처럼 생체 내에서 스스로 빛을 내는 효소-기질 반응이다. 생물 발광을 광원으로 사용하는 경우, 원하는 표적 물질 즉 광감각제에 에너지 전달이 가능한 영역에만 에너지를 전달할 수 있으므로, 병변의 위치나, 깊이와 상관없이 광감각제을 활성화 시킬 수 있다. 본 실험에서 사용한 생물발광 광원은 RLuc8이라는 물질로, 일반적인 루시페라아제에 비해서 4배 이상 밝고, 200배 이상 안정적인 변형물이다. RLuc8의 기질인 coelenterazine-h과 반응하는 경우 480nm 파장의 빛을 내게 되지만, 이 파장의 빛은 chlorin e6라는 2세대 광감각제의 흡수 파장대와 겹치지 않기 때문에, 생물 발광을 직접적으로 사용할 수 없다. 그래서, 655nm의 파장을 내는 양자점을 매개체로 사용하였다. 양자점은 넓은 흡수 파장 대와 좁은 발광 파장 대를 가지고 있기 때문에 coelenterazine-h이 RLuc8과 만나서 발생하는 480nm 파장의 생물 발광을 받아서 chlorin e6의 흡수 영역대인 655nm의 빛을 내게 된다. 이 현상을 생물발광 에너지 전달 (Bioluminescence resonance energy transfer; BRET) 이라고 부른다. 이 생물발광 에너지 전달을 이용하기 위해서 RLuc8과 양자점을 EDC 반응을 이용하여 결합을 시켰고, 결합여부를 스펙트럼과 전자현미경을 이용하여 확인하였다. 이 RLuc8과 양자점 결합체를 이용하여 세포 독성을 확인하였다.
세포 실험에서 coelenterazine-h의 농도가 높아짐에 따라서 더 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 또한 RLuc8과 양자점 결합체가 세포 표면에 붙어있는 세포에서만 세포 독성이 나타나고, 붙어 있는 양이 많을수록 더 빠르게 세포 독성 유발하는 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 이 세포 독성을 유발하는 것은 양자점과 세포막의 chlorin e6 사이에 에너지 전달이 일어남으로써 발생하는 활성산소에 의한다. 게다가, 세포 막에서의 활성산소 발생은 지질과산화를 유발하여 세포막의 손상을 야기했다. 이를 바탕으로 BRET을 기반으로 하는 광역동 치료 중 chlorin e6에 흡수되는 에너지를 측정하여, 레이저를 사용하는 일반적인 광역동 치료 때 흡수되는 에너지와 비교했을 때, 세포막에 있는 chlorin e6를 활성화시키기에는 충분한 에너지의 빛이 RLuc8과 양자점 결합체에서 방사된다는 것을 확인할 수 있었다.
종양을 마우스의 측면에 투여한 실험에서도 세포 실험과 유사하게, coelenterazine-h의 양이 증가할수록 종양의 성장 억제 효과가 더 두드러지게 나타났다. 레이저를 사용한 광역동 치료와 비교할 때도 더 깊은 영역에서 세포 사멸 효과를 확인할 수 있었다. 종양의 성장 억제 효과는 직접적인 세포 독성뿐만 아니라, 종양 혈관에 대해서도 손상을 일으키는 것으로 생각된다. 또한 종양을 마우스의 발에 주입하여 키운 실험에서도 종양은 림프관을 따라서 감시 림프절인 슬와 림프절에 전이를 하게 된다. 이 때 슬와 림프절의 종양 전이는 피부 밑 깊은 곳에 위치하게 되므로, 레이저를 이용한 광역동 치료로는 치료가 불가능하다. 하지만, chlorin e6와 RLuc8과 양자점 결합체, coelenterazine-h를 마우스의 발등의 피하로 투입하는 경우, 림프관을 따라서 슬와 림프절에 도달하게 된다. 이 물질들은 상호 작용에 의해서 슬와 림프절과 슬와 림프절에 있는 암세포에 손상을 일으켰다. 또한, 치료를 시행하지 않은 군에 비해서, 현저하게 폐전이가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
본 연구에서 사용된 BRET을 이용한 새로운 광역동 치료법은 세포실험과 동물 실험에서 레이저를 사용하는 광역동 치료와도 필적할만한 결과를 얻었다. 또한 이전 광역동 치료가 불가능했던 감시 림프절을 수술적인 방법을 거치지 않고, 최소침습으로 치료할 수 있는 임상에 적용이 가능한 치료법을 선보였다. 따라서 이러한 연구 결과는 신체 내부로 빛을 전달하기 어려웠던 광유전학 등의 연구에도 폭 넓게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
