Lipid-based nanomedicine is only of the pioneer nanomaterial used as encapsulation vehicle in attempt for realizing personalized medicine. Liposomes, especially has been used widely in clinics and some others have been approved by FDA as chemotherapeutic agents in cancer therapy; namely Doxil® and Taxane®. Lipid-based micelle and other lipid-coated nanoparticle are also used in nanomedical field. Lipid-based nanoparticle has been deeply studied, in-cluding its physiochemical properties, its uptake mechanism, circulation in human body, sta-bility, tumor uptake efficacy among others. To date, many research groups focused on devel-oping tumor cell specific targeting liposome in order to achieve higher tumor accumulation and better anti-tumor efficacy. In my research, I developed (i) 9R(9-arginine)-targeting liposome, that increases tumor cell uptake by the effect of cell penetrating peptide for decoy oli-godeoxynucleotide (ODN) delivery, (ii) APTEDB-liposome encapsulating doxorubicin, with aptide having high affinity towards tumor associated fibronectin and doxorubicin as anti-cancer agent, (iii) a novel hyper-cell permeable micelle (HCPMi), that has the ability to form sub-20nm micellar formation, by the combination of different lipid length, and at the same time, displays superior cancer cell targeting both in vitro and in vivo, (iv) manipulating the effect of PEG length and targeting ligand density towards the uptake of APTEDB-liposome in vitro and in vivo. It is our vision to develop a lipid-based nanoparticle that is stable, easy to manufacture, long-circulating in vivo with superior tumor specific targeting ability; as to achieve high tumor retention rate and effective cancer therapy.
Chapter 2. In this chapter, I described the methods of making 9R conjugated liposome for encapsulation of ODN. The effective use of oligonucleotide therapeutics, such as antisense oli-godeoxynucleotides (ODNs) and small interfering RNAs (siRNAs), requires efficient delivery systems capable of intracellular penetration. Cell-penetrating peptides (CPPs), including arginine-rich peptides, have been extensively studied as tools for enhancing intracellular uptake efficiency of various bioactive molecules, including nanoparticles and liposomes. CPPs also have an ability to form tight complexes with nucleic acids, such as ODNs and siRNAs,making CPPs effective as packaging agents. Here, I constructed a CPP-modified liposome loaded with complexes of nona-arginine (9R) and NF-kB decoy ODNs, and evaluated intracellular uptake and anticancer activity in vitro. I found that 9R/ODN complexes were efficiently loaded into liposomes that were effectively internalized into U87MG glioblastoma cells and sensitized cells to the effects of paclitaxel. To the best of our knowledge, this is the first report describing the dual use of 9R CPP as a cell penetrating and a complexing agent within a single nanoparticle.
Chapter 3. In this chapter, I described the mechanism of making aptide conjugated liposome. Aptide is a novel targeting ligand, solely produced by our lab, which has very nano-molar af-finity towards target with the advantage of small size, ease of manufacture, no patent issue and most of all, due to lack of disulfide bond in the structure, aptide remains stable in intracel-lular condition. My target is extra-domain B of fibronectin (EDB), which is over-expressed during tumor formation by alternative splicing. By conjugating $APT_{EDB}$ onto the surface of liposome, I speculate that my liposome would be efficiently targeting EDB in tumor proximi-ty, enhance the uptake rate of liposome into the tumor cells and reduce the non-specific uptake of liposome to non-cancerous area, while retaining the ability of liposome to load high amount of cargo (i.e. doxorubicin). As compared to non-targeting liposome, $APT_{EDB}$ -liposome showed significantly higher cellular uptake in U87MG human malignant glioblastoma cell line as compared to non-targeting liposome. Similar result was shown in in vivo targeting ex-periments. I observed around 55% reduction of tumor volume as compared to 26% of parental doxorubicin treatment, and 14% reduction when treated with non-targeting liposome. Taken together, our $APT_{EDB}$ -liposome encapsulating doxorubicin ($APT_{EDB}$ -LS (dox)) might be seen as an efficient drug delivery system.
Chapter 4. In this chapter, I explore the possibilities of different targeting ligand density ver-sus the uptake efficacy. Since early times, research has been done by only using $PEG_{2000}$ as anti-biofouling method. Herein, I also try to find out whether the length of PEG used as anti-biofouling has any significant effect on cell uptake efficacy. I made 4 categories of liposome: (a) $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG _{2000}$ liposome, (b) $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG_{1000}$ liposome, (c) $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{1000}$ liposome, and (d) $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{550}$ liposome, Interestingly, I found out that the optimum aptide percentage on liposome is around 2.5 wt%; with decreasing cell uptake efficiency as aptide percentage increased to 10 wt%. I also observed that with different PEG length used ($PEG_{2000}$, $PEG_{1000}$, $PEG_{550}$), reduced background PEG length showed a general increase in the cellular uptake. When anti-cancer drug doxorubicin (Dox) was loaded into each liposome, the lethal dose of dox LD50 showed the lowest (285.63nM in $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG_{1000}$ liposome), followed by 308.93nM in $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{550}$ liposome. These values are significantly lower than both the $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000} + $PEG _{2000}$ liposome and $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{1000}$ liposome, which showed 647.59nM and 559.18nM respectively. This result correlates well with the in vivo tumor uptake experiment where both $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG_{1000}$ liposome and $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{550}$ showed highest uptake in tumofollowed by $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{1000}$ liposome and the lowest uptake is seen in $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG _{2000}$ liposome. All in all, I observed a marked difference between cellular uptake, and cytotoxicity in different versions of liposome, and concluded that optimization has to be done for each type of nanoparticle to find the best combination of targeting ligand density and PEG length for maximizing therapeutic effects of the said nanoparticle.
최근 많은 관심을 보이고 있는 개인 맞춤형 의학에서 지질(lipid)을 기반으로 한 나노의학은 가장 많은 연구가 진행되어져 온 분야이다. 그중 리포좀(liposome)을 이용한 약물전달시스템은 현재 임상에서 많은 연구가 진행되고 있으며, 대표적으로 Doxil과 Taxane은 FDA 허가를 받아 판매중에 있다. 그외 지질을 기반으로 한 마이셀과 지질이 표면에 코팅된 나노입자들도 많은 연구가 진행되고 있다. 지질을 기반으로 한 나노입자는 안전성과 작용기작, 물리화학적 특성, 생체내 순환 및 암 조직으로의 흡수등에 대해 많은 연구가 진행되어왔으며 논문등을 통해 내용이 알려져 있다. 최근에는 향상된 항암효과와 높은 암조직내 흡수를 위해 암세포에 특이적으로 결합하는 리포좀을 개발하기 위해 많은 연구그룹에서 노력을 기울이고 있다. 본 연구에서도 이러한 흐름에 맞춰 i) 9-알지닌(9R)을 이용한 세포내 흡수를 향상시킨 리포좀을 이용한 핵산 전달시스템 개발, ii) 피브로넥틴 외부 도메인 B(Fibronectin EDB)에 결합하는 항체 유사 펩타이드(이하 앱타이드)가 결합되고 항암제인 독소루비신이 선적된 $APT_{EDB}$ -리포좀 개발, iii) 다양한 탄소 길이의 리피드를 이용하여 세포내 흡수를 향상시킨 20nm이하 크기의 새로운 마이셀(HCPMi) 개발, iv) PEG의 길이와 나노입자 표면의 리간드의 양을 조절하여 최적의 타겟 효과를 나타내는 조건을 찾음으로 향상된 세포내 약물전달 시스템 개발등에 관해 연구하였다. 또한, 본 연구에서는 개발한 나노입자가 안정하며 합성하기 용이하고 생체내 오랜 시간동안 머물러 암 타겟 효과를 높이는 것에 목적을 두고 진행하였다.
먼저 2장에서는 핵산을 선적한 9R이 결합된 리포좀 합성 및 그 효과에 대해 연구하였다. mRNA와 동일한 염기서열을 가지는 안티센스 올리고핵산염(ODNs)과 siRNA와 같은 핵산치료제가 효과적으로 그 기능을 나타내기 위해서는 먼저 세포내로 잘 전달 되어져야한다. 9R과 같은 세포 침투 펩타이드(CPPs)는 다양한 나노입자의 표면에 붙어 다양한 생체 물질의 효과적인 세포내 전달을 위해 많이 사용되어져왔다. 플러스 전하를 띄는 세포 침투 펩타이드는 마이너스 전하를 가지는 핵산과 단단한 컴플렉스 구조를 만들 수 있다. 이번 연구에서는 세포 침투 용으로만 사용되어졌던 9R 펩타이드와 NF-Kb 핵산염를 섞어주어 컴플렉스를 만든후, 리포좀에 봉입시킨후 세포 침투 펩타이드(9R)를 리포좀 표면에 결합시켰다. 이렇게 만든 리포좀을 뇌종양 세포에서 세포내 핵산의 전달 및 항암 효과를 확인한 결과 뛰어난 효과를 나타내는 것을 검증하였다. 본 연구의 의의는 처음으로 세포 침투 펩타이드(9R)를 이용하여 핵산과 컴플렉스를 만들고 또한 리포좀 표면에 동시에 표출시켜 사용한 것이다.
두번째로 3장의 내용은 본 연구실에서 개발한 항체유사 펩타이드(앱타이드)가 결합된 리포좀에 관한 내용이다. 앱타이드는 뛰어난 타겟 리간드로써 수 나노몰의 친화력을 가지며 작은 크기와 화학적 합성이 가능한 점 그리고 황-황 결합이 없어 세포내에서도 그 구조가 변하지 않고 유지하고 있는 장점을 가지고 있다. 이번 연구의 타겟은 암 세포가 생성될 때 많이 발현하는 것으로 알려진 파이브로넥틴의 외부 도메인 B(Fibronectin extra domain B; EDB)이다. 본 연구실에서는 EDB에 결합할 수 있는 EDB 앱타이드를 발굴 하였으며, 이번 연구에서는 EDB 앱타이드를 리포좀 표면에 도입함으로 EDB가 많이 발현하는 암세포에만 특이적으로 결합하고 정상세포내 흡수를 감소시켜, 암세포에만 약물을 전달 시키도록 하였다. 리포좀 내부에 항암제인 독소루비신을 선적시킨후, 타겟팅 앱타이드가 없는 리포좀과 비교 실험한 결과 대조군 그룹에 비해 EDB-리포좀은 약 55% 이상 암조직의 크기를 줄이는 효과를 보였으며, 타겟팅 그룹이 없는 리포좀은 약 14% 정도 효과를 나타내어 EDB가 결합한 리포좀의 우수한 암세포로의 약물 전달 효과를 확인하였다.
세번째로 4장에서는 나노입자 표면의 리간드의 밀도와 세포내 흡수와의 관계에 대해 연구하였으며 또한 PEG의 길이에 따른 생물부착방지 효과(antibiofouling) 및 세포 내 흡수와의 관계에 대해 연구하였다. 이 연구에서 4가지 종류의 리포좀을 합성하였는데, (a) $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG _{2000}$ liposome, (b) $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG_{1000}$ liposome, (c) $APT_{EDB} - $PEG_{1000} + $PEG_{1000}$ liposome, and (d) $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{550}$ liposome 이다. 본 연구에서 앱타이드 표면에 약 2.5 wt% 정도 도입하였을 때 가장 좋은 타겟팅 효과를 보였으며, 10 wt%에서는 오히려 타겟 효과가 줄어듦을 확인하였다. 또한 도입한 PEG ($PEG _{2000}$ , $PEG_{1000}$ , $PEG_{550}$) 의 길이가 타겟 앱타이드에 달린 PEG의 길이($APT_{EDB}$ -PEG) 보다 짧을 때 타겟 효과가 더 좋음을 확인하였다. 동일한 양의 항암제를 선적후 세포 사멸 효과를 관찰한 결과에서, 반수 치사량(LD50)이 $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG_{1000}$ 리포좀 그룹이 가장 낮은 285.63nM 을 보였고, 그 다음으로 $APT_{EDB}$ - $PEG_{1000}$ + $PEG_{550}$ 리포좀 그룹에서 308.93nM 를 보여 647.59nM 을 보인 $APT_{EDB}$ - $PEG_{2000}$ + $PEG _{2000}$ 리포좀 그룹과 559.18nM를 보인 APTEDB-PEG1000 + PEG1000 리포좀 그룹에 비해 확연히 낮은 농도에서 높은 세포 사멸 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 동물 실험에서도 동일한 경향의 결과를 확인하였다. 따라서, 향후 타겟 리간드를 결합한 나노입자를 이용한 약물전달 시스템개발에서는 타겟 리간드양과 PEG의 길이의 최적화가 필요하다고 생각된다.
