Quality of recombinant therapeutic proteins, such as glycosylation, has effects on biological activities, in vivo half-life, solubility, and so on. Due to the importance of quality, Chinese hamster ovary (CHO) cells are the predominant host cell lines for therapeutic proteins because they can produce recombinant proteins having a similar quality with those of human. Recombinant protein quality, expressed in CHO-based production system, can be determined at the stages of genetic sequences, cell lines, culture modes and key parameters of cultivation. In this study, we analyze product quality determined at the stage of cell lines and cultivations and investigate what causes differences of quality. Understanding potential steps and effectors in each step causing varieties of product quality will improve our abilities to control critical product quality in the CHO cell based production system.
DUKX-B11 and DG44 are the widely used CHO host cells for therapeutic protein production. To examine the effect of cell line on therapeutic protein quality, therapeutic Fc fusion protein producing CHO cell lines, originated from DUKX-B11 and DG44 host, were cultivated in batch culture with three temperature conditions. Product qualtity was evaludaed as sialylation quality and isoelctric foucusing (IEF) gel analysis was used for evaluation. By IEF analysis for protein pI isoform distribution, we observed IEF profiles of Fc fusion proteins, expressed by twelve rCHO subclones and they were categorized into two groups based on the location of major pI isoforms. To identify possible causes make the differences of pI isoform, we investigated the effects of cultivation temperature, cell growth profile (cell counts and viability), culture duration, sialidase activity and metabolites affecting product quality. Based on the analysis data, rCHO cells producing acidic pI isoforms as major isoforms had a low sialidase acitivity and they were originated from DUKX-B11 host cells. To identify whether the difference of sialidase acitivity was originated from cell line level, we compared sialidase and sialyltransferase gene expression levels between CHO host cells. DUKX-B11 had about 34.6% of sialidase mRNA expression but, there was no difference in sialyltrnsferase mRNA expression level. Taken together, differences of Fc fusion protein sialylation quality between rCHO cells, were originated from the difference in sialdisade gene expression of CHO host cells.
Therapeutic proteins quality is also determined depending on cell culture modes and key culture process parameters. Fed-batch is a culture mode to feed nutrients selectively based on the predicted requirements of the cell for growth and production. It has been a dominant mammalian cell culture method because it can be possible to get a large amount of therapeutic protein, simple operations and reliabilities. There have been numerous researches for the effects of culture processes and conditions on the resulting glycosylation profile. Despite these efforts to control over product quality like glycosylation, many studies were perfomed in simple culture mode in small scale model and success studies with a particular mammalian cell lines expressing a particular protein do not carry over to others. For understanding these differences, we investigate the effects of culture moed, temperature, DO and pH on product quality during fed-batch cultures using stirred bioreactor. Fc fusion protein with relatively low sialylation was produced in batch culture, as compared to fed-batch culture, and it might be caused by deficiency of essential nutrient involved in glycosylation. Temperature shift down had a dominant effect to maintain sialic acid contents but there were no differences in sialic acid contents between bi-phasic and tri-phasic temperature shift down. DO 30 condition was preferable culture conditions in terms of high sialylation of Fc fusion protein but, pH shows no significant effect on product quality. Although pH and DO are also critical process parameters, their effect on product quality might be minor than temperature.
Therapeutic protein quality like glycosylation has a complex metabolic pathway. It is characterized by step-wise addition and removal of individual monosaccharides and variety of enzymes related to glycosylation are involved. For depth understanding glycosylation pathways, numerous comparative transcriptomic analyses on rCHO cells have been conducted with a targeted quantitative polymerase chain reaction (PCR) but, its application is limited due to its low scalability in terms of the number of genes analyzed. So, we investigated fifty-two N-glycosylation-related gene expressions changes in rCHO cell producing Fc fusion protein using an emerging technology, NanoString nCounter system. The addition of NaBu to the production process reduced the relative proportion of acidic pI isoforms and sialic acid content of the glycoprotein. Fifty-two N-glycosylation-related gene expressions were also assessed by the NanoString nCounter system which can measure a direct digital readout using custom-designed color-coded probes. Among them, ten genes (ugp, slc35a2, ganc, man1a, man1c, mgat5a, st3gal5, glb1, neu1, and neu3) were up-regulated and three genes (b4galt2, st3gal3, and neu2) were down-regulated significantly. Altered expression patterns in st3gal3, neu1, and neu3, which have the roles in the sialic acid biosynthesis pathway, correlated with the reduced sialic acid content of the glycoprotein by NaBu.
In conclusion, product quality is influence by host cell line and culture condition in fed-batch and the measurable phenotypic quality changes correlate with the gene expression profile changes. Taken together, the results obtained in this study provides a better understanding to produce therapeutic proteins with a cocnsistent and preferable quality profile.
치료용 재조합 단백질에서 당쇄와 같은 품질은 생물학적 활성, 체내 반감기, 용해도 등에 영향을 미친다. 이와 같은 품질의 중요성 때문에 인간의 체내 존재하는 단백질과 가장 유사한 품질의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 CHO 세포가 치료용 재조합 단백질 생산에 숙주세포로 널리 사용되고 있다. CHO 기반 생산 시스템에서 생산된 재조합 단백질의 품질은 유전자 서열, 세포주, 배양 방법 및 주요 공정인자에 의해 결정된다. 본 연구에서는 세포주 및 배양 환경에 의한 재조합 단백질의 품질 차이를 분석하고, 어느 요인에 의해 품질 차이가 발생하는 지를 밝히고자 하였다. 이러한 품질 차이를 유발하는 단계 및 잠재적인 인자에 대한 이해는 CHO 세포 기반 생산 시스템에서 주요 품질을 조정할 수 있는 능력을 향상하는데 도움이 될 것이다.
DUKX-B11과 DG44 세포주는 치료용 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 CHO 숙주 세포주이다. 세포주에 의한 치료용 재조합 단백질 품질에 미치는 영향을 조사하기 위해 DUKX-B11 및 DG44 숙주세포에서 기원한 Fc 융합 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주를 세가지 온도 조건의 회분식 배양을 수행하였다. 품질은 시알산화 품질로 평가하였으며, 등전점 전기 영동법을 이용하여 시알산 품질을 평가하였다. 12종의 재조합 CHO 세포주에서 생산된 Fc 융합 단백질에 대한 등전점 전기 영동법 분석 결과 주요 등전점 동형 단백질 (pI isoform)의 분포에 형태에 따라 크게 두 개의 패턴 집단으로 나누어지는 것을 확인하였다. 패턴을 발생시키는 원인을 파악하기 위해 배양 온도, 세포수 및 생존율, 배양 기간, 시알산 분해효소 활성 및 잠재적인 품질 영향 대사물질에 대한 영향 평가를 실시하여, DUKX-B11를 숙주 세포주로 사용한 재조합 CHO 세포주의 세포 배양액에서 상대적으로 낮은 시알산 분해 효소 활성을 확인하였고, 해당 세포주에서 생산된 Fc 융합 단백질의 경우 시알산 함량이 높은 산성의 등전점 동형 단백질 비중이 높음을 확인하였다. 이러한 차이의 발생 원인이 두 가지 CHO 숙주 세포주 본래의 시알산 전달 효소 및 분해 효소의 mRNA 발현량 차이에 의한 것인지를 확인하기 위한 비교 실험 결과 시알산 전이 효소의 발현량은 차이가 없으나, DG44 숙주 세포주에서는 DUKX-B11 대비 약 2.9배 높은 시알산 분해효소 활성을 확인하였다. 이러한 숙주 세포 본래의 시알산 분해효소 발현 수준차이로 인해 치료용 Fc 융합 단백질의 품질 차이가 발생하였음을 확인하였다.
치료용 재조합 단백질의 품질은 세포 배양법 및 주요 공정인자에 의해서도 결정된다. 유가식 배양법은 세포 성장 및 단백질 생산을 위해 세포가 필요로 하는 영양분을 선택적으로 주입하는 배양 방법으로 비교적 단순하게, 반복적으로 단백질을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있어 치료용 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 배양 방법이다. 기존에 배양 환경이 단백질의 품질에 미치는 영향에 대한 많은 연구가 진행되었지만, 주로 단순한 회분식 배양 방법에서 소규모로 연구가 진행되었고 특정 세포 및 단백질에만 국한되는 경우가 많아 다른 세포 및 단백질 생산에는 적용 재현이 되지 않는 경우가 많았다. 본 연구에서는 회분식 배양 및 유가식 배양을 통해 생산된 Fc 융합 단백질의 품질 비교를 통해 회분식 배양에서 생산된 Fc 융합 단백질에서 시알산 함량이 낮음을 확인하였고, 이는 당쇄화에 필수 영양분의 고갈에 의해 기인함을 간접 확인하였다. 또한, 유가식 배양법에서 주요 공정 인자인 배양온도, 용존 산소량 및 pH에 의한 품질 영향 평가를 통해 공정 중 배양 온도 감소 전략이 치료용 Fc 융합 단백질의 시알산 함량을 높게 유지하는데 가장 효과적임을 확인하였다. 배양 중 용존 산소량을 30으로 유지하는 것이 높은 시알산화에 유리함을 확인하였으나, pH는 시알산화 품질에 미치는 영향이 미미함을 확인하였다.
치료용 단백질의 당쇄화 공정은 매우 복잡하여 여러 종류의 효소가 관여하는 단계 별 단당류 첨가 및 제거 반응을 통해 완성된다. 이 복잡한 당쇄화 경로에 대한 이해를 높이기 위해 기존에는 중합효소 연쇄 반응을 통한 CHO 세포 내 유전자 전사체 연구가 기존에 진행되었지만 소수의 동시 분석만 수행할 수 밖에 없는 단점이 있었다. 본 연구에서는 다수의 유전자 전사체 동시 분석이 가능한 최신 나노스트링 분석 기술을 최초로 CHO 유전자 발현 패턴 분석에 적용하여 생산상 증가를 위해 첨가하는 뷰티르산 염 처리 유무에 따른 52개의 N-당쇄화 관련 유전자 발현 변화를 관찰하였다. 뷰티르산 염 처리 시 총 52개의 당쇄 관련 유전자 중 10개 유전자 (ugp, slc35a2, ganc, man1a, man1c, mgat5a, st3gal5, glb1, neu1, and neu3)의 상향 발현 조절 및 3개 유전자 (b4galt2, st3gal3, and neu2)의 하향 발현 조절을 확인하였다. 이중 시알산 분해효소 2종 (neu1, neu3)의 발현 상향 조절 과 시알산 전이효소 1종 (st3gal3)의 발현 하향 조절 변화는 뷰트르산 염 처리 시 시알산 함량이 낮은 염기성의 등전점 동형 단백질의 비중이 높아지는 단백질 품질 차이를 설명해 준다.
결론적으로 치료용 재조합 단백질의 품질은 CHO 숙주세포 및 배양 환경에 의해 영향을 받음을 확인하였으며, 이러한 품질의 변화는 품질 관련 유전자 발현의 변화와 상관관계가 있음을 확인하였다. 본 연구 결과는 CHO 세포주 및 배양 환경에 따른 품질 변화에 대한 이해를 높여 향후 원하는 품질 수준의 치료용 단백질을 일관되게 생산하는데 도움이 될 것이다.
