Host cell factor 1 (HCF-1) is a highly conserved transcriptional regulator that participates in formation of various transcription regulatory complexes. HCF-1 undergoes an unusual proteolytic maturation process to generate $HCF-1_N$ and $HCF-1_C$ subunits that remain noncovalently associated via self-association sequence elements. Here, I present the crystal structure of the self-association sequence 1 (SAS1) and the C-terminal nuclear localization signal (NLS) showing that the SAS1 elements from each of the $HCF-1_N$ and $HCF-1_C$ promotes the association by forming an interdigitated fibronectin type 3 (Fn3) tandem repeat structure. I also show that the C-terminal NLS is required for effective formation of a transcriptional regulatory complex: the herpes simplex virus VP16-induced complex formation. Interestingly, the basic residues of NLS play critical role in both VIC formation and nuclear localization. Thus, this study reveals that the role of self-association via an interdigitated Fn3 structure is to hold the $HCF-1_N$ and $HCF-1_C$ subunits together to facilitate a transcriptional regulatory complex formation by recruiting the NLS. In addition, these results present a novel function of NLS to promote the VIC formation suggesting that the NLS of HCF-1 has dual function in localizing HCF-1 to the nucleus and promoting VIC formation.
DNA에 저장된 유전 정보는 전사를 통해 RNA로 전달되고 RNA로 전달된 유전 정보는 다시 번역에 의해 단백질로 전달이 된다. 이렇게 만들어진 단백질은 세포 내에서 에너지 생성, 호르몬 변화의 감지, 세포 분열의 조절, 세포 내에서의 신호 전달 및 다른 단백질의 기능 조절 등과 같은 역할을 수행하게 된다. 이와 같이 DNA로부터 단백질과 같은 기능적인 산물이 만들어 지는 것을 유전자 발현이라고 한다.
세포 내에 존재하는 수많은 유전자들은 각각의 유전자에서 발현되는 단백질의 기능에 따라 지속적으로 발현되기도 하고, 발현이 계속 억제되기도 하며, 외부의 자극에 따라 발현과 억제가 반복되기도 한다. 이를 위하여 유전자 발현은 수많은 방법에 의해 시간적 그리고 공간적으로 매우 정교하게 조절된다. 특히, 유전자 발현 과정의 첫 번째 단계인 전사 과정은 필요한 순간에만 유전자의 발현이 바로 시작될 수 있도록 굉장히 많은 수의 다양한 단백질들에 의해 조절되고 있다. 전사 과정은 발현되어야 하는 유전자의 promoter나 enhancer 부위에 transcription factor, chromatin remodeler, histone modifying enzyme, polymerase 와 같은 단백질들이 결합하며 전사 조절 복합체가 형성됨으로써 그 시작이 조절된다.
전사 조절 복합체를 이루는 단백질 중에서 transcription regulator로 작용하는 HCF-1은 다양한 단백질들과 상호 작용하며 여러 전사 조절 복합체를 형성한다. HCF-1 단백질은 단순포진 바이러스의 단백질인 VP16과도 전사 조절 복합체 (VP16-induced complex, VIC)을 형성하여 단순포진 바이러스의 immediate-early 유전자의 발현을 유도한다. 하지만, 생명체 내에서 다양한 유전자의 발현에 관여하면서 바이러스가 자신을 복제하기 위해 사용하는 효율적인 대상이 되기도 하는 HCF-1이 어떻게 전사 조절 복합체의 형성에 관여하는지는 정확하게 알려져 있지 않다.
사람의 HCF-1 단백질은 세포 내에서 합성된 이후에 OGT 단백질에 의해 두 부분으로 잘리게 된다. $HCF-1_N$ 과 $HCF-1_C$ 라고 부르는 두 부분은 잘린 뒤에도 SAS1과 SAS2 두 도메인을 통하여 서로 결합해있는 상태로 존재한다. 이렇게 HCF-1 단백질이 합성되고, 두 부분으로 잘린 뒤에도 서로 결합해 있는 상태를 HCF-1 단백질의 자가 결합이라고 한다. 본 연구에서는, HCF-1 단백질의 자가 결합의 원리를 밝히기 위하여 SAS1 도메인의 3차원 구조를 규명하였다.
SAS1은 $HCF-1_N$ 에 존재하는 $SAS1_N$ 과 $HCF-1_C$ 부분에 존재하는 SAS1C의 결합으로 이루어져 있다. 기존의 연구 결과에 의하면 SAS1C는 Fn3 도메인 구조를 형성하고 SAS1N이 그 표면에 결합한다고 예상되었다. 그러나 본 연구에서 규명한 SAS1과 SAS1의 카르복시 말단에 존재하는 NLS의 3차원 구조를 보면 SAS1N과 SAS1C가 서로 깍지를 낀 것처럼 서로 맞물리면서 Fn3 도메인 구조를 형성하고 있음을 알 수 있다. 2035개의 아미노산을 가지는 매우 큰 HCF-1 단백질에서, 1400개 이상의 아미노산의 차이로 서로 멀리 떨어져 있는 SAS1N과 SAS1C가 흥미롭게도 합성 과정 중에 서로 결합하면서 하나의 도메인을 형성하고 있는 것이다.
SAS1N과 SAS1C에 의한 자가 결합 부위는 예쁜꼬마선충에서부터 초파리, 쥐, 그리고 사람까지 진화적으로 잘 보존되어 있다. SAS1의 구조를 보면, 진화적으로 잘 보존된 아미노산들이 SAS1N과 SAS1C의 결합 표면에 존재하고 있다. 이를 통하여 SAS1N과 SAS1C에 의한 자가 결합이 진화적으로도 중요한 것을 알 수 있다. 따라서 SAS1에 의한 자가 결합이 HCF-1 단백질이 전사 조절 복합체를 형성하는데 어떠한 역할을 하는지 분자 생화학적인 방법을 통하여 알아보았다. 그 결과, SAS1 부위가 손상되어 $HCF-1_N$ 과 $HCF-1_C$ 의 자가 결합이 일어나지 않으면 HCF-1 단백질이 VIC을 형성하지 못하는 것을 확인하였다. 또한 $HCF-1_N$ 과 $HCF-1_C$ 부위를 glycine linker를 통해 물리적으로 연결한 경우에는 SAS1 부위가 손상되거나 SAS1을 제거해도 HCF-1 단백질이 VIC을 형성하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 SAS1은 VIC 형성에 직접적으로 관여하지 않고 $HCF-1_N$ 과 $HCF-1_C$ 가 함께 존재하도록 함으로써 전사 조절 복합체를 형성하는데 관여한다는 것을 알 수 있었다.
다음으로 HCF-1 단백질의 어느 부분이 VIC을 형성하는데 직접적으로 관여하는지 알아보았다. 이를 위해 HCF-1 단백질의 카르복시 말단 부위를 3차원 구조에 따라 여러 부분으로 나누고 어느 부분을 제거한 경우에 VIC이 형성되지 않는지 조사하였다. 그 결과, 단백질을 핵으로 이동시키는데 필요한 NLS 부위가 제거된 경우에 HCF-1 단백질이 VIC을 이루지 못하는 것을 확인하였다. 또한, 단백질을 핵으로 이동시키는데 필요한 염기성을 갖는 아미노산들이 HCF-1 단백질이 VIC을 이루는 데에도 필요하다는 것을 확인하였다. 이를 통해 HCF-1 단백질의 NLS가 HCF-1 단백질이 VIC을 형성하는데 중요한 역할을 한다는 사실을 밝힘으로써 기존에 알려진 NLS의 역할에 더해 새로운 NLS의 기능을 제시하였다.
이어서, HCF-1 단백질의 NLS가 VIC 형성에 어떻게 관여하고 있는지 VIC의 3차원 구조를 규명하고자 했다. 이를 위하여 HCF-1 단백질이 VIC을 이루는 다른 단백질들과 결합하는 부위로 알려진 kelch 도메인과 SAS1, NLS를 대량 발현 및 정제하였다. 그리고 정제된 HCF-1 단백질이 in vitro로 발현되었을 때와 동일하게 정제된 VP16, Oct-1과 VIC을 형성하는 것을 확인하였다. 또한, HCF-1과 VP16 복합체를 대량 정제하여 VIC 또는 VIC의 부분복합체의 구조를 규명할 수 있는 발판을 마련하였다.
요약하면, 본 연구에서는 합성 후에 두 부분으로 잘리는 HCF-1 단백질의 자가 결합 부위의 구조를 규명하고 분자 생화학적인 방법을 통하여 자가 결합 부위가 HCF-1 단백질이 전사 조절 복합체를 형성하는데 중요하다는 것을 밝혔다. 그리고 HCF-1 단백질의 카르복시 말단에 존재하는 NLS가 VIC 형성에 중요하다는 사실을 발견함으로써 NLS의 새로운 기능을 밝혔다. 따라서, HCF-1의 NLS는 전사 조절 복합체의 형성 촉진 및 단백질의 핵으로의 이동에 관여하는 두 가지의 기능을 가진다는 사실을 밝혔다. 마지막으로, Kelch 도메인을 포함한 HCF-1 단백질을 대량 발현, 정제함으로써 VIC의 3차원 구조를 규명할 수 있는 발판을 마련하였다.
