Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) is one of nine poly Q diseases. Poly Q expansion of ataxin-1 (ATXN1) protein causes SCA1 disease. In the nucleus, ATXN1 has two binding partners, CIC and RBM17, which compete for ATXN1 binding. CIC binds to the AXH domain of ATXN1, and RBM17 interacts with ATXN1 by recognizing phosphorylated C-terminal 776 serine. Poly Q expansion promotes the formation of ATXN1 and RBM17 complex. The imbalance of the formation of these two complexes might contribute to pathogenesis. Here, I report about the biological implication of the crystal structure of ATXN1 and CIC complex solved by x-ray crystallography, and validation of the structure model of ATXN1 and RBM17 by biochemical studies.
Firstly, I determined the crystal structure of ATXN1 AXH domain and CIC complex. In the structure, CIC peptide binds to the hydrophobic pocket of the AXH domain, disrupting the homo-dimerization of the AXH domain. Furthermore, the crystal structure revealed that the AXH domain and CIC complex was reconfigured to make a new form of dimer via CIC peptides.
Next, the structure of ATXN1 and RBM17 complex was modeled using RBM17 and ULM5 crystal structure as a template. The modeled structure of ATXN1 and RBM17 complex was validated by mutagenesis studies. Furthermore, I showed that phosphorylation of C-terminal 776 serine, and 773 arginine of ATXN1 are important for RBM17 binding by biochemical approaches.
These results might provide a molecular mechanism of SCA1 pathogenesis by identifying the reconfiguration of ATXN1 dimerization via CIC, and present molecular interactions between ATXN1 and RBM17.
폴리 글루타민 퇴행성 뇌 질환은, 그 질병 원인 단백질의 글루타민 아미노산 반복서열의 확장으로 인해 발병이 되는 상염색체 우성유전성 신경 질환이다. 현재까지 총 9가지의 폴리 글루타민 질병들이 알려져 있으며, 대표적으로는 척추소뇌성 운동실조증, 헌팅턴씨 병 등이 있다.
척추소뇌성 운동실조증 유형 1 (Spinocerebellar Ataxia Type 1, SCA1) 질병은 ATXN1 단백질의 폴리 글루타민 부분의 확장에 의해서 발병한다고 알려져 있으며, 보행장애, 부정확한 발음, 불균형, 근력저하, 연하장애 등의 증상을 보인다. ATXN1 단백질은 몸 전체에서 발현되는 87KDa 정도 크기의 단백질이다. 여러 연구를 통해 ATXN1이 전사의 조절과 RNA 대사와 관련된 단백질이라고 알려져 있지만, 정확한 기능은 알려져 있지 않다. 이 단백질의 특징으로는 N-말단 부분에 폴리 글루타민 반복서열이 존재하고 중간에 AXH 도메인과 C-말단 부분에 인산화가 되는 세린 아미노산이 존재를 한다. 정상인 사람의 ATXN1 단백질의 경우, 6-44개의 글루타민 반복서열을 가지고 있는 반면, 환자의 경우 39-83개의 반복서열을 가진다. 글루타민 반복서열 개수에 의존 또는 독립적으로, AXH 도메인과 인산화된 세린 아미노산을 통해서 여러 종류의 결합 단백질들이 ATXN1 단백질과 상호작용을 한다고 알려져 있다.
세포 핵 안에서, ATXN1은 전사 억제 단백질인 Capicua (CIC) 단백질 또는 mRNA 스플라이싱 인자인 RBM17 단백질과 결합하여 복합체를 형성 할 수 있다.
CIC는 ATXN1의 AXH 도메인에 결합을 하며, RBM17은 C-말단의 인산화된 세린을 인지하여 결합한다. 정상 ATXN1의 경우 CIC와의 복합체 형성을 선호하며, 글루타민이 확장 된 ATXN1은 RBM17과 훨씬 높은 비율로 복합체를 형성한다. 이러한 두 복합체의 불균형한 형성이 에 척추소뇌성 운동실조증 유형 1 질병의 발병을 일으킬 것이라는 보고가 있다.
이 연구에서, 척추소뇌성 운동실조증 유형 1의 발병에 관한 분자적인 기작을 이해하고자, ATXN1-CIC와 ATXN1-RBM17 복합체들에 대해 구조 및 생화학적 연구를 수행하였다.
Part 1 : ATXN1과 CIC 복합체 - ATXN1 AXH 도메인과 CIC의 복합체 형성과 재형성
CIC는 전사 억제 인자로서, 소뇌 등의 과립세포의 발달 동안에 발현이 되며 중추신경계의 발달에 중요한 역할을 한다. 선행연구에서, 척추소뇌성 운동실조증 유형 1의 표현형을 가진 쥐에서 CIC의 양을 줄였더니, 표현형이 50%나 치료된다는 보고가 있었는데. 이 결과는 ATXN1에 대한 CIC의 결합이 질병의 발병에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 ATXN1과 CIC 복합체의 결합 기작을 밝히는 것이 발병 기작을 이해하는데 중요할 것이라 생각하여 연구를 진행하였다.
CIC의 N-말단 부분이 ATXN1의 AXH 도메인과 결합한다고는 알려져 있었지만, 이 두 단백질이 어떻게 상호작용하여 복합체를 형성하는지는 알려져 있지 않았다. 따라서 X-선 결정학과 생화학적 연구를 통해 ATXN1의 AXH 도메인과 CIC의 N-말단 부분의 펩타이드의 상호작용을 밝혔다.
ATXN AXH 도메인과 CIC 펩타이드 복합체 구조에서, CIC 펩타이드는 ATXN1 AXH 도메인 표면 전하분포도에서 소수성 포켓에 안정적으로 결합하고 있으며, CIC 펩타이드 소수성 잔기들과 ATXN1 AXH 도메인의 소수성 잔기들이 소수성 상호작용을 하고 있다.
구조를 보면서 이것이 단순한 복합체의 구조가 아닌, 흥미로운 점을 발견하였다. ATXN1 AXH 도메인의 구조는 2004년도에 규명이 되었었고, 이 도메인이 용액상에서 N-말단을 이용해 동질이형체(homo-dimer)를 만든다는 사실이 알려져 있었다. 하지만 CIC가 ATXN1 AXH 도메인에 결합하면, AXH 도메인의 동질이형체를 만드는 N-말단 쪽 표면에 결합을 하면서 이 동질이형체를 분리시킨다는 점이다. CIC의 결합으로 인해 동질이형체가 분리가 되지만, 또 하나의 흥미로운 발견 중에 하나는 ATXN1 AXH 도메인과 CIC 복합체가 다시 CIC끼리의 결합으로 인해 이질사형체 (heterotetramer, ATXN1-CIC-CIC-ATXN1)를 형성한다는 것이다. 생화학적 실험을 통해 실제로 세포 안에서도 이런 기작이 존재한다는 것을 증명하였다. 즉, 전사 억제 인자인 CIC에 의해 ATXN1의 구조가 동질이형체에서 이질사형체로 재형성이 과정이, ATXN1이 전사의 조절에 어떻게 관여를 하는지, 또한 이러한 전사의 조절이 척추소뇌성 운동실조증 유형 1 질병에 미치는 영향에도 실마리를 제공할 수 있을 것이라 생각한다. 또한 폴리 글루타민 퇴행성 뇌 질환 관련 단백질 복합체의 형성에 대하여 분자학적, 구조학적으로 처음 밝혔다는 의의를 가진다.
Part 2 : ATXN1과 RBM17 복합체 ? 구조 모델링을 통한 ATXN1과 RBM17 복합체의 결합 기작의 규명
RBM17은 스플라이스좀 (splicesome)의 구성 단백질로서 mRNA 스플라이싱 조절에 관여를 한다. RBM17은 폴리 글루타민이 확장 된 ATXN1과 더 많은 비율로 상호 작용을 하며, ATXN1의 인산화된 C-말단 세린을 인지하여 결합한다고 알려져 있다. 초파리를 이용한 실험에서 폴리 글루타민이 확장 된 ATXN1만 있을 때에는 척추소뇌성 운동실조증 유형 1이 발병이 되지 않지만, RBM17이 결합함으로써 발병이 된다는 것이 밝혀졌고, 따라서 RBM17의 결합이 폴리 글루타민이 확장 된 ATXN1의 유독성을 중재하는 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 그러므로 ATXN1과 RBM17의 상호작용을 밝히는 것이 척추소뇌성 운동실조증 유형 1의 발병 원인을 알아내는데 중요한 역할을 할 수 있기 때문에 연구를 시작하게 되었다.
RBM17도 많은 결합 단백질을 가지고 있는데, 선행연구에서 RBM17과 SF3b155 단백질의 ULM5 모티프 복합체의 구조가 밝혀져 있었다. 흥미롭게도, 구조에서 RBM17과 결합하고 있는 ULM5의 아미노산 서열이, 이미 RBM17과의 binding에 중요하다고 알려진 ATXN1의 아미노산 서열과 비슷하다는 것을 얼라인먼트를 통해 알아내었다. 그 정보를 바탕으로, 이화여자대학교 최선 교수님 연구실과의 공동연구를 통해 RBM17-ULM5 구조를 견본으로 하여 RBM17-ATXN1의 구조 모델링을 하였다.
돌연변이 생성 등의 생화학적 연구를 통해 복합체 모델 구조가 타당한지와 결합 기작을 밝혔고, 또한 그 동안 알려져 왔던 ATXN1 C-말단의 인산화 된 세린이 RBM17과의 결합에 중요하다는 것을 생화학적 접근으로 처음으로 보여 준 연구였다.
