Most biological processes such as DNA replication, transcription, translation, cell adhesion, protein folding, protein and nucleic acid unfolding, protein degradation, and membrane fusion are operated systematically by molecular machinery, especially proteins. To reveal the molecular mechanism of the machinery, it is inevi-table to observe and manipulate molecules at the molecular level. We studied the molecular machinery for membrane fusion using single molecule measurement techniques such as electron microscopy, single-molecule fluorescence, and single-molecule force spectroscopy which have been developed and will be de-veloped by biophysicists in the future. Here, we show the molecular mechanism of the assembly and disas-sembly of the SNARE complex, the key molecular machinery for membrane fusion.
First of all, we observed the intermediates of membrane fusion using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM) and single-vesicle fluorescence during yeast SNARE complex formation. We could directly visualize two kinds of intermediates - one is two bilayers are on the contact part of two vesicles (two-stacked bilayers state) and the other is the state that one bilayer is on the contact part between two vesicles (hemifusion diaphragm). Moreover, we observed that incorporating 35 % PE into vesicles can increase hemi-fusion diaphragm populations. Therefore, we conclude the following: 1) Vesicle fusion intermediates can be captured in cryo-TEM samples. In addition, we can observe hemifusion diaphragm which has been observed using other methods. 2) The geometry of PE lipids can stabilize hemifusion diaphragm. We also directly visu-alized fusion pore opening, which is initiated from an edge of the vertex ring (where boundary and outside membrane meet on docked vesicles) and the residual membrane was one bilayer. Therefore, we concluded that hemifusion diaphragm might not be a nonproductive end state of the fusion reaction.
Secondly, we reconstituted and characterized NSF/$\alpha$ -SNAP mediated SNARE complex disassem-bly using single molecule fluorescence methods and single molecule force spectroscopy. The results are as follows: 1) NSF uses one-round ATP turnover to disassemble SNARE complex. 2) $\alpha$ -SNAP not only tightly connects NSF to the SNARE complex, but also destabilizes the C-terminal part of the SNARE complex to support the action of NSF. 3) the SNARE complex is disassembled in a single burst within 20 ms by NSF. These show that the molecular mechanism of NSF is different from other AAA+ ATPases such as helicase or protein unfoldase which are known to progressively unwind substrates. Our results show how an AAA+ ATPase can induce global unwinding of a substrate protein complex, which turns out to be a much more effi-cient mechanism than processive unwinding.
대부분의 생물적인 작용들은 주로 단백질들로 이루어진 분자 기계들로 체계적으로 작용된다고 간주된다. 나노 수준으로 이루어진 분자 기계들의 기작을 연구하기 위해서는 분자 수준의 이미징 기술과 분자 수준으로 제어하는 기술이 필요하다. 우리는 생물리학자들이 그 동안 개발해왔고, 최근까지도 계속 개발이 진행되고 있는 단분자 측정 기법인 전자현미경 기법, 단분자 형광 기법, 그리고 단분자 힘 분광학 기법을 이용하여 생체막 융합현상을 일으키는 분자 기계들의 작동에 대해 연구했다. 우리는 생체막 융합 현상을 일으키는 핵심 분자 기계라고 간주되어 오고 있는 SNARE 단백질의 조립과 분해 과정을 단분자 측정 기법으로 연구하였다.
먼저 단 소포체 형광 측정 기법과 전자현미경 기법으로 생체막 융합현상에서 SNARE 단백질 조립이 진행될 때 생체막이 어떤 형태로 바뀌면서 생체막 융합이 진행되고 완료되는지를 관찰하였다. 그 결과 두 생체막이 나란히 붙어 있는 중간 상태 (Two-stacked bilayers docked state)와 두 생체막이 붙어 있는 부분이 단일 생체막으로 바뀌면서 판막이 형태로 바뀐 Hemifusion dia-phragm 을 관찰하였다. 이는 이 두 가지 상태가 안정적으로 존재한다는 것을 이야기 한다. 또한 PE 인지질을 35 % 첨가해주면 Hemifusion diaphragm 이 더 많이 관찰되었는데 이는 전자 현미경에서도 생체막 융합 과정이 기존에 봤던 것을 뒷받침 할 수 있다는 것과 함께, PE 인지질의 기하구조가 Hemifusion diaphragm 을 더 안정화 시켜준다는 것을 직접적으로 뒷받침 하는 결과가 된다. 또한 Hemifusin diaphragm 이 한 쪽 끝에서부터 열리는 과정 이미지도 관찰이 되었는데 이 결과를 통해 그 동안 논란이 되어 왔던 Hemifusion diaphragm 이 더 이상 생체막 융합으로 진행할 수 없는 불량품이 아니라 생체막 융합 과정으로 진행되는 과정 이라는 것을 밝혀냈다.
또한, 단분자 형광기법과 단분자 힘 분광학 기법을 이용하여 NSF/ $\alpha$ -SNAP 에 의한 SNARE 단백질 복합체의 분해를 재구성하였고, 이 기법으로 NSF/ $\alpha$ -SNAP 분자 기계가 SNARE 복합체의 분해를 어떻게 하는지를 다음의 결과로 규명했다. 1) NSF 의 단 한번의 ATP hydrolysis cycle 로 분해가 된다. 2) $\alpha$ -SNAP 이 NSF 와 SNARE 복합체를 단단하게 연결시켜주는 것만 아니라 SNARE 단백질 복합체를 C 쪽 말단을 선택적으로 불안정화 시켜준다. 3) ATP hydrolysis 는 SNARE 단백질을 단방에 (< 20 ms) 풀어낸다. 이 세가지 결과는 기존의 다른 AAA+ ATPase인 Helicase 또는 Proteasome 이 점진적으로 풀어내는 모델 (Processive unwinding model) 과 다른 모델임을 시사하고 있다. 이 결과로 우리는 NSF 는 전체를 한번에 풀어내는 모델 (Global un-winding model) 을 따른다고 결론 내리게 되었다.
본 연구 결과는 그 동안 개발 되어온 전자현미경법, 단분자 형광기법, 단분자 힘 분광계가 지금까지 생물학적으로 밝혀내지 못했던 많은 분자 기계들의 작동 기작을 설명하게 만드는 패키지 실험도구가 될 것이라고 기대한다.
