Streptomyces strains have a wide range of substrate specificity and produce enzymes such as cellulase, xylanase, amylase, β-glucosidase etc, and this makes them good candidates for bioproducts production using biomass hydrolysate containing many different monosaccharides and disaccharides. A pet operon containing two genes from Zymomonas mobilis that are responsible for ethanol production, pyruvate decarboxylase (pdc) and alcohol dehydrogenase II (adhII), were constructed. They were heterologously expressed in Streptomyces lividans TK24. An examination of carbon distribution revealed that a significant portion of carbon metabolism was switched from cell mass and organic acid biosynthesis to ethanol production upon their expression.
As a molecular strategy to increase the expression level of AdhII, a thiostrepton-inducible tipA promoter was inserted in front of the adhII gene, which resulted in the construction of Tpet module. The strain transformed with Tpet module was named as S. lividans TK24/Tpet. The activity of AdhII with Tpet module was 2.75-fold higher than that with pet operon promoter with a higher ethanol yield. S. lividans TK24/Tpet was able to produce ethanol from glucose with a yield of 23.7% (46.7 % of the theoretical yield). It produced ethanol from xylose, L-arabinose, mannose, L-rhamnose, galactose, ribose, and cellobiose with yields of 16.0%, 25.6%, 21.5%, 33.6%, 30.6%, 14.6% and 33.3% based on the consumed substrates, respectively. It also showed an ethanologenic capability on polymeric substances such as starch and xylan, with yields of 18.9% and 13.0%, respectively. A careful examination on substrate uptake rates and ethanol production rates among the carbon sources mentioned above reveals that both rates are closely related each other. A carbon source with a higher uptake showed an ethanol production rate. This implies that excess carbon flux over the oxidation capacity of S. lividans TK24/Tpet was diverted to ethanol biosynthesis.
Existence of catabolic repression by glucose and thus its effects on the utilization of each carbon source were investigated. Glucose of 10 g/L was added to the fermentation medium containing 10 g/L of galactose, xylose, L-arabinose, mannose, L-rhamnose, ribose, or cellobiose. All of the above-mentioned carbon sources were utilized simultaneously with glucose, implying that the catabolic repression by glucose was not significant. Knowing that a hydrolysate of biomass in general is a mixture of glucose and many other carbon substrates, simultaneous utilization of glucose and other sugar is a huge advantage in using biomass hydrolysates as a feedstock for fermentation.
Providing a microbial platform having a broad range of substrate specificity is valuable for efficient utilization of biomass which comprises of a variety of carbon sources, such as lignocellulosic or microalgal biomass. Noticeably, this is the first incident of using a genetically engineered Streptomyces strain for bioethanol production and demonstrating its broad substrate specificity with significant ethanol yields.
국제유가 폭등 및, 환경오염에 따른 청정에너지 개발의 필요성에 따라 바이오에탄올의 수요는 계속해서 증가할 전망이다. 바이오매스의 생화학적 변환을 통한 바이오에탄올 생산은 매우 환경 친화적이나 그 효율을 극대화할 수 있는 연구기반이 필수적으로 요구되며, 기존의 전분질을 원료로 한 에탄올생산의 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 방안으로 목질계 및 해조류 바이오매스가 대두되고 있다. 목질계 및 해조류 바이오매스의 당화액은 glucose뿐만이 아니라 galactose, xylose, L-arabinose, L-rhamnose, mannose, cellobiose 등 매우 많은 종류의 당을 포함하고 있다. 그러나 에탄올 발효에 주로 이용되고 있는 Saccharomyces cerevisiae및 Zymomonas mobilis등의 균주는 성장과 미생물 발효에 이용할 수 있는 기질이 한정되어 있다는 단점을 가진다. 따라서 본 연구에서는 바이오 매스 당화액 내에 존재하는 거의 모든 종류의 당을 생장에 활용 가능한, 즉 기질활용도가 넓은 Streptomyces lividans TK24를 에탄올 생산의 호스트로 선정하였다. 또한 본 균주에 Zymomonas mobilis 에 존재하는 에탄올 생산 유전자인 pyruvate decarboxylase와 alcohol dehydrogenase II를 클로닝하여 형질전환하고 형질전환된 균주를 이용하여 glucose, galactose, xylose, L-arabinose, mannose, L-rhamnose, cellobiose 와 xylan 등을 기질로 이용하여 에탄올을 생산하는 연구를 수행하였다.
에탄올 생산에 필요한 두 가지 유전자, pyruvate decarboxylase와 alcohol dehydrogenase II 는 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화 되었으며 이를 ermE promoter를 가진 방선균용 고발현 벡터인 pUWL201PW에 삽입하고, pet operon으로 명명하였다. Pet operon으로 형질전환된 S. lividans TK24/pet는 glucose와 galactose를 모두 다 기질로 잘 이용하여 에탄올을 생산하였다. glucose에 의한 에탄올 yield는 21.5%였으며 galactose로부터는 16.6%의 수율로 에탄올을 생산하였다. 또한 오탄당인 xylose로부터도 5.8%의 높은 에탄올 수율을 보였다. 특히 다른 균주는 거의 사용하기 어려운 cellobiose를 기질로 하여 15.2%의 매우 높은 에탄올 수율을 나타내어, 본 연구의 기본 목적인 분해가 어려운 biomass로부터 에탄올을 생산하는 데 있어 방선균이 매우 유용한 균주가 될 것임을 증명하였다. starch함유배지에서 잘 자라는 방선균의 특성대로 starch를 기질로 하여 15%의 에탄올 수율을 얻었으며 특히 CM-cellulose와 xylan으로부터도 에탄올 생산이 가능하다는 결과를 얻었다.
S. lividans TK24/pet의 cell free extract로부터 발현된 Pdc와 AdhII의 엔자임 활성을 측정한 결과, pet operon의 뒤쪽에 위치한 alcohol dehydrogenase II의 엔자임 활성이 pyruvate decarboxylase보다 상대적으로 낮은 경향이 있었고 이와 같은 두 엔자임 간의 불균형은 한정된 기질로부터 더 높은 수율의 에탄올을 얻는데 걸림돌이 될 가능성이 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 pet operon의 단점을 개선하기 위해, pet operon의 두 번째 유전자인 alcohol dehydrogenase II 앞에 또 다른 강력한 promoter인 tipA를 도입하였고, 이 모듈을 pet operon과 구분하기 위해 Tpet으로 명명하였다. tipA의 도입을 통해 AdhII의 활성은 0.075U에서 0.185U로 증가하였다. AdhII의 활성이 강화된 Tpet module의 방선균에의 형질전환을 통해 다양한 기질로부터 전반적인 에탄올 생산속도와 기질소모 속도의 증가를 확인하였다. 특히 에탄올의 수율의 증가보다 에탄올 생산속도와 기질의 소모속도의 증가가 더욱 두드러지는 결과를 얻었다. Glucose의 소모속도는 $0.269 g \cdot L^{-1} \cdot hr^{-1}$ 에서 $0.530 g \cdot L^{-1} \cdot hr^{-1}$ 로 증가하였고, 에탄올의 생산속도도 $0.079 g \cdot L^{-1} \cdot hr^{-1}$ 에서 $0.109 g \cdot L^{-1} \cdot hr^{-1}$ 로 증가하였다. Cellobiose의 경우도 기질의 소모속도가 $0.229 g \cdot L^{-1} \cdot hr^{-1}$ 에서 $0.533 g \cdot L^{-1} \cdot hr^{-1}$ 로 증가하는 결과를 보였다. 테스트한 모든 기질에서, Tpet으로 형질전환된 균주는 pet으로 형질전환된 균주보다 4~16.2%의 증가된 수율을 나타내었다.
본 연구는 최초로 방선균을 통해 에탄올을 생산해낸 사례이며, 현재까지 밝혀져 있지 않던 방선균의 에탄올 내성을 보고하였고, 추가적인 유전자조작 없이 다양한 기질로부터 에탄올을 직접 생산해 냄으로써 바이오매스의 당화액을 에탄올 생산에 활용하는 미생물의 플랫폼을 제공하는 데 기여할 것으로 예상된다.
