In recent years, an intense interest has grown in the interactions of biomolecules such as nucleic acids and proteins with metal ions. Examples of such novel interactions include the specific binding of aptamers with metal ions and selective incorporation of metal ions as cofactors to promote the catalytic activities of nucleic acid enzymes (deoxyribozymes or ribozymes). Certain metal ions like $Hg^{2+}$, $Ag^{+}$, $Cu^{2+}$, $Ni^{2+}$, and $Co^{2+}$ are shown to specifically bind to natural or artificially modified nucleosides to form metal ion-mediated base pairs. In addition, on the basis of well-established binding modes between nucleic acids and metal ions, inorganic nanomaterials such as silver nanoclusters and quantum dots have been synthesized by utilizing nucleic acids as bio-mineralization templates. Likewise, proteins have been utilized to produce inorganic nanomaterials with the different shapes, sizes, and crystal structures. A representative example includes the protein-directed synthesis of fluorescent gold nanoclusters, which are prepared by the reduction capability of bovine serum albumin. Based on the aforementioned unique interactions between biomolecules and metal ions, we have developed a novel biosensing technology for metal ions, biological thiols, and drug molecules such as theophylline and coralyne.
In chapter 2, we have designed a new strategy in which a polymerase enzyme is controlled to accomplish an unnatural extension reaction even at the mismatched site of a primer with template DNA. The validity of this novel concept has been systematically demonstrated by using metal ions ($Hg^{2+}$ and $Ag^{+}$ ions) to intentionally trigger an unusual illusionary polymerase activity at respective T-T and C-C mismatched primers on the basis of their specific interactions with the respective mismatched base pairs (T-T and C-C). Being different from previous efforts in which interactions of nucleic acids with metal ions were studied, the current investigation has probed these interactions in combination with polymerase activity. A novel strategy to construct molecular scale logic gates has been also developed based on the unnatural polymerase activity induced by metal ions. The successful operation of the key logic gates has been demonstrated by rationally designing primers and selecting the type of DNA polymerase employed. The most notable feature of the logic gates devised herein is their simplicity and cost-effective design since the only requirement for the construction of logic gates is the incorporation of a single mismatched base (T and C) at the 3’ end of the primer and the application of metal ions ($Hg^{2+}$ and $Ag^{+}$ ions).
In chapter 3, a new technology that enables the reliable detection of silver ions has been developed. The method takes advantage of the unique fluorescence property of a mismatched pyrrolo-dC (PdC)-modified duplex DNA, which serves as the key detection component, and the specific interaction of this duplex with silver ions. The new sensing strategy exhibits high selectivity and sensitivity and it does not require the use of procedures to pre-incorporate fluorophore or quencher labels. The latter feature is one of the greatest merits of the new fluorescence-based method. In addition, the novel concept has been successfully extended to the detection of biological thiols that is based on their specific and tight binding to silver ions. To the best of our knowledge, this is the first study showing that a specific interaction of a metal ion (e.g., $Ag^{+}$ ions) with a fluorescent mismatched nucleobase pair can be employed as the basis for a new type of metal ion sensing system. As a result, the observations made in this study serve as the basis of new sensing strategies that utilize the optical and binding properties of nucleobases and/or their analogs.
In chapter 4, a novel, label-free, fluorescent, turn-on sensor for biological thiol detection that uses highly fluorescent gold nanoclusters (AuNCs), prepared by a bovine serum albumin (BSA)-templated green synthetic route, has been developed. This assay relies on blocking $Hg^{2+}$ -induced quenching of fluorescent AuNCs, caused by metallophilic $Hg^{2+}-Au^+$ interactions, through selective coordination of biological thiols with $Hg^{2+}$ ions. Biogical thiols entrap added $Hg^{2+}$ ions via a robust Hg-S interaction. This phenomenon prevents $Hg^{2+}$ -induced quenching and results in high fluorescence from the AuNCs. By employing this turn-on sensor, biological thiols, such as cysteine (Cys), glutathione (GSH) and homocysteine (Hcy), have been successfully detected at concentrations as low as 8.3 nM for Cys, 9.4 nM for GSH, and 14.9 nM for Hcy. The diagnostic capability of this method has also been demonstrated by detecting biological thiols in human blood serum, showing the great potential in the practical applications. The observations made in this study should aid the design of other fluorescence-based turn-on biosensors that broaden the applicability of AuNCs.
In chapter 5, we have devised a novel, label-free, fluorescent sensor for sensitive and selective detection of theophylline utilizing abasic-site-containing duplex DNA as dual purposes; one is the synthesis template for fluorescent silver nanoclusters and the other is the binding pocket for theophylline. The strategy relies on theophylline-controlled formation of fluorescent silver nanoclusters from abasic-site-containing duplex DNA. In the absence of theophylline, silver ions can interact with the cytosine opposite the abasic site in duplex DNA, which allows the efficient formation of fluorescent silver nanoclusters. In contrast, the presence of theophylline, which pseudo base pairs with the cytosine opposite the abasic site and is stabilized by nucleobases flanking the abasic site in duplex DNA, inhibits silver ions from binding the cytosine nucleobase. Consequently, fluorescent silver nanoclusters cannot be formed. As a result, assay samples that do not contain target theophylline display an intense red fluorescence signal while those containing theophylline show a significantly reduced fluorescence signal. This difference can be easily detected even with the naked eye under a hand-held UV lamp. By employing this new fluorescent sensor, theophylline is successfully analyzed at the concentration as low as 1.8 μM with the high selectivity over the structurally related methylxanthine derivatives and other molecules present in serum. The diagnostic capability of this method is also demonstrated by detecting theophylline in human blood serum, showing its great potential in the practical applications.
In chapter 6, a novel, label-free, fluorescent turn-on detection system for screening of homo-adenine binding molecules, which employs DNA-templated silver nanoclusters (DNA-AgNCs) as a key detection component, has been developed. The new strategy relies on the formation of Non-Watson-Crick homo-adenine DNA duplex through the high affinity interaction between adenine-rich DNA sequence and its binding molecule, which brings guanine-rich sequence in proximity to DNA-AgNCs. This phenomenon transforms the weakly fluorescent AgNCs into the highly emissive species, which results in the emission of bright red fluorescence. By using this turn-on assay, we have successfully identified a coralyne molecule, which is known to selectively bind to homo-adenine and subsequently trigger the formation of non-Watson-Crick homo-adenine DNA duplex. Importantly, this new method is well suited to high-throughput screening system for the identification of candidate molecules binding to homo-adenine because it is simply operated without the complicated modifications and technical expertise.
최근 들어, 생체 물질 (핵산 및 단백질) 과 금속 이온의 특이적인 상호작용을 이용한 연구가 주목을 받고 있다. 이와 같은 특이적인 상호작용의 예로는 특정 금속 이온과 결합하는 압타머 (aptamer) 및 효소 촉매 활성을 위한 조효소로서 특정 금속 이온과의 결합을 필요로 하는 nucleic acid enzymes (deoxyribozymes or ribozymes) 등이 보고되어 있다. 이 외에도 핵산의 nucleobase 혹은 합성된 nucleobase 가 금속 이온과의 특이적인 배위 결합을 통해 안정화 된 염기쌍을 형성 할 수 있다는 것이 보고되어 있다. 또한, 핵산과 금속 이온의 특이적인 상호작용을 기반으로 은 나노클러스터 (silver nanoclusters) 및 양자점 (quantum dots) 과 같은 무기 나노물질의 생성을 위한 템플릿으로 핵산이 사용되고 있다. 이와 유사하게, 단백질을 이용하여 유해한 환원제의 도움 없이 다양한 무기 나노물질을 생성할 수 있다는 사실 역시 보고되어 있다. 그 대표적인 예로는 혈청 알부민의 환원 능력을 통해 제작되는 형광 특성을 띄는 골드 나노클러스터 (gold nanoclusters) 가 있다. 본 연구에서는 상기 설명 드린 생체 물질과 금속 이온간의 특이적인 상호작용을 이용하여 금속 이온, 생물학적 티올 (biological thiols), 그리고 테오필린 (theophylline) 및 코랄린 (coralyne) 과 같은 약물 분자의 검출을 위한 새로운 바이오 센싱 기술을 개발하였다.
제 2 장에서는 본 연구의 첫 번째 주제로서 핵산 중합효소 (DNA polymerase) 가 주형 DNA 와 짝이 맞지 않는 염기쌍에서도 신장 반응을 일으킬 수 있도록 유도하는 새로운 방법을 디자인하였다. 이 방법은 수은과 은 이온이 각각 짝이 맞지 않는 티민-티민 (thymine-thymine) 및 시토신-시토신 (cytosine-cytosine) 염기쌍과 배위 결합을 통해 안정화 시킬 수 있다는 기존의 사실을 바탕으로, 짝이 맞지 않는 염기쌍에서도 수은과 은 이온에 의한 안정화 된 염기쌍 형성을 통해 비정상적인 핵산 중합 활성을 유도 해 낼 수 있었다. 기존의 핵산과 금속이온의 상호작용 연구와 달리, 본 연구는 중합효소의 활성 유도에 금속이온의 상호작용을 도입함으로써 새로운 발견을 이루어낼 수 있었다. 또한, 이 원리를 이용하여 금속 이온의 존재 유무 판별 및 더 나아가서 금속 이온의 조합에 의해 논리적인 출력 신호 조절을 가능하게 하는 논리게이트 (YES, PASS1, AND, OR gate) 를 구현 할 수 있었다. 이 방법을 통해 구현된 논리 게이트는 값비싼 RNA 및 복잡한 시스템 설계를 요구하지 않으며, 간단하게 프라이머의 3’말단에 티민 혹은 시토신 염기의 첨가를 통해 주형 DNA 와 잘못 짝지어진 염기쌍을 형성하도록 설계함으로써 손쉽게 작동 가능하다는 장점을 가지고 있다.
제 3 장에서는 자연계에 존재하는 시토신과 유사한 결합 특성을 가지며 동시에 형광 특성을 띄는 pyrrolo-dC 형광 염기 유사체를 이용하여 새로운 은 이온 검출 시스템을 개발하였다. 구체적으로, 잘못 짝지어진 pyrrolo-dC-cytosine 염기쌍이 은 이온과의 특이적인 상호작용을 통해 형광 신호의 감소를 일으킬 수 있다는 사실을 처음으로 발견하였으며, 이를 바탕으로 민감도와 특이도가 우수한 은 이온 검출 기술을 개발할 수 있었다. 또한, 은 이온과 특이적인 결합 능력을 보이는 생물학적 티올 (biological thiols) 의 검출 가능성을 볼 수 있었다. 이 방법은 기존의 형광 신호 기반 은 이온 검출 센서와 비교하여 형광 및 소광제 (quencher) 물질의 표지가 필요 없다는 장점을 가지고 있다.
제 4 장에서는 혈청 알부민의 환원 능력에 의해 제작된 형광 특성을 띄는 금 나노클러스터를 이용하여 특별한 형광 물질의 표지가 필요 없는 생물학적 티올 (biological thiols) 검출 기술을 개발하였다. 이 방법은 수은 이온과 특이적인 결합 능력을 보이는 생물학적 티올 (biological thiols) 이 수은 이온에 의한 금 나노클러스터의 형광 신호 소광 (quenching) 현상을 저해함으로써 발생하는 금 나노클러스터의 높은 형광 신호를 측정함으로써 이루어진다. 이 기술을 이용하여, 시스테인 (cysteine), 글루타티온 (glutathione) 및 호모시스테인 (homocysteine) 과 같은 생물학적 티올 (biological thiols) 을 우수한 민감도와 특이도를 가지고 분석해 낼 수 있었다. 또한, 혈액 내에 존재하는 생물학적 티올 (biological thiols) 을 검출해 냄으로써, 이 방법의 실제 임상 적용 가능성을 확인해 볼 수 있었다.
제 5 장에서는 abasic-site 를 포함하는 이중 가닥 DNA 를 이용하여 값비싼 형광 물질의 표지가 필요 없는 쉽고 간편한 테오필린 (theophylline) 검출 기술을 개발하였다. 이 방법은 abasic site 와 마주보며 배열된 시토신이 은 이온과의 상호작용을 통해 형광특성을 띄는 은 나노클러스터를 형성 할 수 있다는 사실과 테오필린 (theophylline) 약물과 특이적으로 결합할 수 있다는 기존의 사실을 토대로, 테오필린 (theophylline) 약물이 형광특성을 띄는 은 나노클러스터의 형성을 저해할 수 있다는 사실을 규명하였으며, 이를 기반으로 테오필린 (theophylline) 약물의 존재 유무를 진단 해 낼 수 있었다. 이 기술을 이용하여, 1.8 μM 의 검출 한계 (LOD: limit of detection) 를 가지고 표적물질 테오필린 (theophylline) 에 높은 특이도를 보이며 성공적으로 분석해 낼 수 있었다. 또한, 혈액 내에 존재하는 테오필린 (theophylline) 을 정확하게 분석해 냄으로써, 실제 임상 샘플의 분석 가능성을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 시도된 테오필린 (theophylline) 약물에 의한 은 나노클러스터의 형성 조절 및 이를 기반으로 한 형광 검출 시스템의 개발은 보고된 바 없으며, 기존에 보고된 검출 시스템과 비교하여 값비싼 형광물질의 표지를 필요로 하지 않고 간단하게 수행 될 수 있다는 장점을 가지고 있다.
제 6 장에서는 DNA 를 템플릿으로 제작된 은 나노클러스터를 이용하여 아데닌 (adenine) 이 풍부한 DNA 에 결합하는 물질을 손쉽고 간편하게 검출할 수 있는 기술을 개발하였다. 이 방법은 아데닌이 풍부한 DNA 와 그에 결합하는 물질의 상호작용을 통한 아데닌 이중가닥 DNA (homo-adenine duplex DNA) 의 형성 및 이를 통한 은 나노클러스터와 구아닌 (guanine) 이 풍부한 DNA 의 거리 조절에 기반을 두고 있다. 이 현상은 결과적으로 약한 형광 신호를 띄는 은 나노 클러스터를 높은 형광 신호를 띄는 상태로 전환시키게 된다. 이 기술을 이용하여 아데인이 풍부한 DNA 에 결합하고 이를 통해 아데인 이중 가닥 DNA (homo-adenine duplex DNA) 의 형성을 유발한다고 알려진 콜라린 (coralyne) 을 성공적으로 분석해 낼 수 있었다. 이 방법은 복잡한 형광 신호 물질의 표지 및 전문적인 기술을 요구하지 않기 때문에 아데인이 풍부한 DNA 에 결합하는 후보 물질의 빠른 선별을 위한 high-throughput system 으로 손쉽게 적용될 수 있다는 장점을 가지고 있다.
