Based on the reports on bacterial ability to selectively target and grow in the necrotic regions of the solid tumor, the use of bacteria as a potential tool for cancer therapy has emerged as a promising alternative for currently practiced methods such as chemotherapy and radiation therapy. With advances in molecular and genetic engineering, it is now possible to develop bacterial strains possessing specific cancer targeting capabilities with attenuated toxic effects and immune responses. While numerous demonstrations have shown bacterial targeting the tumor to reduce its size, the actual mechanism for the observed phenomenon remains unclear. Therefore, this study aims to investigate the entire process of bacterial cancer targeting and invading the host cells.
To study the differential bacterial interaction with normal versus cancer cells, we chose Salmonella typhimurium and Escherichia coli to be inoculated to normal (THLE-2) and cancer (HepG2) hepatocytes in this work. HepG2 cells were found to be more vulnerable to bacterial infection than normal THLE-2, resulting in much lower survival after 90 minutes of infection. Following the infection, cancer cells were found to exhibit more prominent alterations in cytoskeletal actin for S.typhimurium and more severe disruption in microtubule for E.coli, indicating differential contribution of cytoskeletal proteins in bacterial invasion in a strain-dependent manner. Since myosin II plays a critical role in actin filament regulation, host cells were treated with two chemical agents to inhibit or to enhance the activity of myosin II and the results showed direct correlation between myosin II activity and the survival of cells against S.typhimurium infection. Quantification of myosin II confirmed that the inherently high level of myosin II and its activity in HepG2 must have facilitated S.typhimurium infection, leading to higher necrosis. On the other hand, preventing microtubules to dissociate by chemical treatment had induced significant increase in cancer cell survival against E.coli infection, suggesting dissociation of microtubule is critical for E.coli entry into hepatocytes.
A couple of possible explanations for bacterial targeting of solid tumors have been suggested: one of which being bacterial cells’ favoring hypoxic environment at the core necrotic regions of tumor caused by diffusion-limited insufficient supply of oxygen and nutrients, and the other possibility being the positive chemotactic behavior of bacteria toward cancer released specific biochemical factors. However, to this date, there has not been any direct evidence on which of these assumptions is critical in regulating the bacterial preference for cancer cells. Therefore, we developed a simple microfluidic platform to visualize bacterial preference for cancer over normal cells and to elucidate the cancer-targeting mechanism of bacteria. This platform allows simultaneous cultures of multiple cell types in independent culture environments in isolated multi-chambers, and creates a stable chemical gradient across a collagen-filled passage between each of these cell culture chambers and the central channel. The established chemical gradient induces chemotactic preferential migration of bacteria for quantitative analysis. Preference analysis of S.typhimurium and E.coli toward normal and cancer hepatocytes using the platform revealed an apparent preference of both bacterial strains for cancer cells. We then demonstrated that the bacterial cancer-targeting mechanism is a strain-dependent process where each bacterial strain involves different targeting molecule through independent pathways.
Lastly, bacterial invasion in 3D tissue-like microenvironment was studied using a novel 3D microfluidic platform. Bacteria find their way into cancer primarily by invading and traveling in blood vessels, and thus studying how cancer cells influence the surrounding endothelium to facilitate bacterial accumulation at tumor sites is critical. Stable endothelial lumen structures were successfully generated with a VEGF gradient across the channel. When endothelial vessels were simultaneously cultured with normal and cancer hepatocytes, differential growth rates of vessels were obtained in which cancer cells induced significantly faster growth with higher permeability evidenced by more leakage of fluorescently labeled proteins across the vessels. Injecting bacteria into the endothelial vessels in the platform induced higher accumulation of bacteria toward the cancer cells. These results indicate that cancerous environment may modulate the integrity and dynamics of sprouting vessels, increasing the apparent permeability of the endothelial cell-cell junctions and inducing faster growth, which in turn would provide better track for bacteria to reach and accumulate near the tumor site.
19세기부터 박테리아는 암 조직 또는 세포에 대해 지향성을 보이는 것이 관찰되어왔고, 이러한 현상에 착안하여 박테리아를 이용한 암 치료법을 개발하고자 하는 노력이 지속되고 있다. 박테리아는 선호하는 조건의 방향으로 능동적이고 빠르게 이동하는 특성을 보이며, 유전자 조작을 통해 보유하는 특성을 배가하거나 억제할 수 있어 현재 실시되고 있는 화학, 방사능 요법 등의 수동적인 암치료 방법의 효과적인 대안으로 각광 받고 있다. 실제 박테리아를 이용해 대장암과 유방암과 같은 몇 가지 고형 암의 경우 암을 지향하고 치료한 사례가 동물실험 결과를 토대로 보고된 바 있지만, 박테리악 암을 찾아내고 침투하는 직접적인 원인은 아직 밝혀지지 않고 있다. 이에 본 연구는 박테리아가 암과 정상 세포 사이에 박테리아 침투 및 세포사멸에 미치는 효과의 차이 확인과 박테리아의 표적 지향 성능에 대해 분석하여 박테리아가 암을 추적하는 근본적인 원인을 밝혀내고자 하였다.
본 연구에서는 암과 정상 세포 사이에 박테리아의 세포 침투 및 사멸의 차이 분석을 위해 간의 정상과 암 세포에 대항하는 THLE-2와 HepG2에 살모넬라 (Salmonella typhimurium)과 대장균 (Escherichia coli)을 일정시간 동안 감염시키고, 그 영향을 세포역학적인 관점으로 고찰하였다. 90분의 감염시간 동안 HepG2는 THLE-2에 비해 현저히 낮은 생존율을 보여 박테리아의 감염에 더 취약한 것으로 파악할 수 있었다. 살모넬라와 대장균의 감염은 각각 세포의 액틴 골격 구조의 급격한 변화와 미세소관의 해리를 유도하였고, 이는 HepG2에서 더 두드러지게 나타나는 것을 확인하였다. 이에 따라 균주에 따라 세포를 침투하는 경로가 다른 것을 예상할 수 있었으며, 정상 세포에 비해 암 세포가 더 원활한 침투가 이루진다는 것을 볼 수 있었다. 화학물 처리를 통해 액틴 골격 구조의 조절에 중요한 역할을 담당하는 마이오신 II의 활성을 조절한 결과 살모넬라 감염은 마이오신 II의 활성과 직접적인 상관 관계가 있음을 알 수 있었으며, 정량화를 통해 HepG2가 월등히 높은 양의 마이오신 II와 활성을 보유함을 확인할 수 있었다. 이에 따라 간 세포의 살모넬라의 침투는 마이오신 II의 활성에 따라 조절된다고 결론 지을 수 있었다. 반면 대장균 감염의 경우, 미세소관의 해리를 억제를 통해 세포의 생존률이 월등히 증가하는 것을 확인함에 따라 미세소관의 해리가 간세포로의 대장균 침투에 필수적임을 확인할 수 있었다.
박테리아가 암을 선호하는 원인은 암 조직의 발생과 성장과정에서 유추할 수 있다. 암 조직은 정상의 조직과 비교하여 비정상적으로 빠른 증식으로 하게 되는데, 이로 인해 조직 내부에 균일하지 않은 산소와 영양분 공급이 발생하게 되고, 암 조직은 이를 극복하기 위해 혈관 등의 생성을 유도하는 생화학적인 물질들을 과분비하게 된다. 따라서 박테리아가 암을 지향하는 특성은 암 조직 내의 원활하지 못한 산소 공급으로 인해 발생하는 산소 결핍 환경과 박테리아가 암 세포에서 특이적으로 분비되는 생화학적 물질에 대해 보이는 주성이라 추정할 수 있다. 하지만 현재까지 박테리아가 암을 찾아내는 정확한 원인은 밝혀지지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 박테리아가 정상세포에 비해 암세포를 선호하는 직접적인 원인을 분석할 수 있는 미세 유체 플랫을 설계 및 제작하였다. 설계된 소자는 다중의 세포를 독립적인 공간에서 배양함과 동시에, 콜라겐 막의 다공성의 성질을 이용해 세포 배양을 통해 발생하는 여러 물질들을 중앙 박테리아 채널로 확산을 통해 농도 구배를 형성할 수 있도록 설계되었고, 이를 통해 박테리아 지향성의 정량적인 분석을 가능케 했다. 간 정상과 암세포에 대한 살모넬라와 대장균의 지향성 분석 결과, 두 균주 모두 암세포에 대해 높은 지향성을 보이는 것을 관찰하였으며, 이는 각 균주에 따라 서로 다른 물질에 의한 것임을 확인하였다.
마지막으로, 조직과 유사한 3차원의 환경을 구축할 수 있는 미세유체플랫폼을 개발하고, 이를 이용해 암, 정상 조직, 혈관으로 이루어진 미세환경에서의 박테리아 암 추적 및 침투 기작을 분석하였다. 박테리아는 숙주 내에서 혈관을 통해 이동하고 침투하여 암에 도달하기 때문에 암 세포가 혈관에 미치는 영향을 분석하고, 또 이것이 박테리아의 침투에 어떤 영향을 미치는지에 대한 분석이 필요하다. 개발된 미세유체플랫폼을 이용해 혈관 내피세포 성장 인자의 농도 구배를 유도하여 루멘의 구조를 가지는 안정된 혈관을 형성하였다. 이 후 형성된 혈관이 간 암과 정상세포와 함께 각각 공생배양되었을 때, 간 암세포가 혈관의 투과율을 높여 보다 더 빠른 성장을 유도하는 것을 관찰하였다. 박테리아가 형성된 혈관에 주입되었을 때, 암 세포의 방향으로 박테리아의 뚜렷한 지향성을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 암의 환경이 주위 혈관의 혈관내피세포간의 결합의 약화를 통한 혈관의 투과성을 높여 더 빠른 혈관의 생성을 유도하는 것을 알 수 있었으며, 결국 이 과정은 박테리아의 침투에 긍정적인 영향을 미침을 파악할 수 있었다.
