Spider dragline silk is an extremely strong and elastic fiber that makes it attractive for numerous applications. There have been many attempts to make similar high quality fibers by biomimetic spinning of recombinant dragline silk proteins. However, production of native-sized recombinant silk proteins (250-320 kDa) has been unsuccessful because of the innate limitation of Escherichia coli expression system. This study aim to produce native-sized recombinant dragline silk protein with higher titer in E. coli. The 96-repeats dragline silk protein of Golden orb-weaver spider was properly expressed in E. coli cell possessing elevated pool of glycyl-tRNA and co-overexpressed factor for inversion stimulation (Fis) which encodes the transcriptional activator of ribosomal RNA operons. Co-overexpression of Fis was assumed to enhance the expression level of 96-repeats Golden orb-weaver spider dragline silk protein by the mechanism of up-regulation of the ribosomal pool and several translation related protein in the nutritious environment. For the production of 96-repeats Black widow spider dragline silk protein, the host strain E. coli BLR strain was employed to minimize homologous recombination of recombinant gene. When RraA encoding RNase E inhibitor protein was co-overexpressed with Fis, the expression level of 96-repeats Black widow spider dragline silk protein was dramatically enhanced. Finally, fed-batch fermentation of E. coli BLR strain which engineered to co-overexpress Fis and RraA, resulted in $0.7 g l^{-1}$ of the 96-repeats Black widow spider dragline silk protein at the 10 hour after induction. These results provide insight into general genetic strategies for expression of proteins with high molecular weight and repetitive genetic structure to achieve higher production in E. coli.
거미드래그라인 실크 (Spider dragline silk)는 높은 강도와 탄력성을 가져 다양한 산업 분야의 신소재로서 각광을 받고 있다. 이러한 거미실크섬유를 대량생산하기 위해, 재조합 거미드래그라인 실크 단백질로부터 자연의 거미실크와 동일한 강도를 가진 실크 섬유를 제조하는 연구들이 오랫동안 이루어져 왔다. 그러나 거미드래그라인 실크 단백질은 그 크기가 매우 크고 고반복 서열을 가지고 있어, 재조합 숙주에서 그 발현이 거의 이루어지지 않는다는 문제점을 갖고 있었다. 본 연구에서는 Golden orb-weaver 거미와 Balck widow 거미의 드래그라인 실크 단백질을 재조합 단백질 생산에 보편적으로 사용되는 균주인 대장균에서 대량 생산하는 방법을 개발하였다. 먼저 약 280kDa, 96회의 반복 서열을 가진 두 재조합 단백질의 발현 플라스미드가 구축되었으며, 글리실-tRNA (glycyl-tRNA)를 보충하기 위한 플라스미드와 함께 대장균으로 형질전환되었다. 이에 리보솜 (ribosome)의 생합성을 증가시키는 것으로 알려진 전사인자인 Fis를 재조합 Golden orb-weaver 거미드래그라인 실크 단백질과 발현시켰을 때, 실크 단백질의 발현량이 증가하는 현상을 발견하였다. 또한 Fis가 추가 발현된 Golden orb-weaver 거미드래그라인 실크 단백질을 생산하는 대장균의 단백체 분석 결과로부터, Fis 추가발현이 단백질 생합성 과정에서 중요한 몇 개의 유전자들의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다. 이후에 Balck widow 거미의 드래그라인 실크 단백질도 대량 생산하기 위하여, Balck widow 거미의 드래그라인 실크 유전자를 상동재조합이 이뤄지지 않도록 조작된 대장균 BLR 균주에 형질전환 시켰다. 여기에 Fis 추가발현 전략을 적용하였을 때 실크 단백질의 발현량이 증가한 것을 볼 수 있었으며, 따라서 앞에서 개발된 전략이 Balck widow 거미의 드래그라인 실크 단백질의 대량 생산에도 유효함을 알 수 있었다. 이에 리보핵산분해효소 E (RNase E)의 저해제인 RraA까지 추가적으로 발현 시켰을 때, Balck widow 거미의 드래그라인 실크 단백질의 발현량이 더욱 증가한 것을 볼 수 있었다. 최종적으로, Fis와 RraA가 추가발현된 Balck widow 거미의 드래그라인 실크 생산균주의 유가배양으로부터 대략 $0.72g l^{-1}$ 의 실크 단백질을 수확할 수 있었다. 본 연구에서 제시된 유전적 전략들은 거미실크 단백질과 같은 고분자량의 고반복서열을 가진 다양한 단백질들을 대장균에서 대량생산하는 데에 적용될 수 있을 것이다.
