Free fatty acids are merely carboxylic acids with long hydrocarbon chains. They are produced when fats are broken and considered as good fats. Free fatty acids can be used as precursors of fatty acid methyl esters (FAMEs) which are used as diesel. Currently, alternative fuels of which feedstock is originated in the nature or which was made by biological methods have been greatly interested as they do not increase the net carbon dioxide, one of the greenhouse gases that enhance radioactive force and contribute to global warming.
Rhodococcus opacus PD630 is able to accumulate lipids up to 76 or 87% of the cellular dry mass as triacylglycerides (TAG), diacylglycerides (DAG) and wax esters etc. respectively. To produce free fatty acids using these lipids, the genes encoding TAG lipase, monoacylglyceride (MAG) lipase from other organisms were overexpressed in R. opacus PD630 using the R. opacus PD630-Escherichia coli shuttle vectors. For accumulating lipids in R. opacus PD630, mineral salt media (MSM) cultivation was optimized and MSM cultivation without nitrogen source was used. Produced free fatty acids from these cultures were chemically converted into FAMEs by methylation.
As a result, the mutant R. opacus PD630 strain was able to produce free fatty acids with 50% of free ratty acids yield from glucose in contrast with R. opacus PD630 wild strain having ability to produce with 33.5% of free fatty acids yield from glucose. From these fatty acids, FAME ?? diesel was produced by chemical method and the concentration was 5.393g/l using free fatty acids which were produced from fed-batch fermentation.
유리지방산은 다른 물질과 결합하고 있지 않은 지방산으로 대부분 트리글라이세라이드가 분해되면서 생산된다. 지방산은 탄화수소 사슬이 카복시산에 결합된 형태를 가지고 있으며 탄화수소 사슬을 이루는 탄소의 개수에 따라 그 특성이 달라지게 된다. 지방산은 그 자체로도 유용하게 쓰이지만, 알코올과 반응하여 지방산 알킬 에스테르 형태가 되면 디젤 기관을 운전하는 디젤로서 사용할 수 있다. 현재 전세계 적으로 석유연료를 대체할 에너지를 찾는 연구를 하고 있는데 바이오디젤의 원료로 사용되오던 식물기름이나 동물성 지방은 식량으로서도 사용되기 때문에 원재료의 가격과 공급에 종종 문제가 일어난다.
이에, 글루콘산 나트륨을 사용해 질소가 제한된 조건에서 세포질량대비 최대 76%까지 트리글라이세라이드를 쌓을 수 있는 로도코코스 오페이쿠스 PD630 균주를 이용해 유리지방산을 과생산 하는 것에 주력하였다. 이렇게 과생산된 유리지방산은 화학적인 방법으로 지방산 알킬 에스테르로 쉽게 전환이 가능하기 때문이다. 우선 정보가 잘 알려지지 않은 균주의 생장과 세포 내의 트리글라이세라이드 축적량을 늘리기 위해 다양한 배양 조건 변화를 통해 배양조건을 최적화 하였다. 그리고 세포 내에 축적된 트리글라이세라이드를 높은 효율로 유리지방산으로 분해시킬 수 있도록 다른 미생물에서부터 라이페이즈를 도입하였다. 이렇게 도입된 라이페이즈는 아세트아마이드 존재 하에 발현되어 원하는 시기에 트리글라이세라이드를 유리지방산으로 분해시킬 수 있었다. 외부 라이페이즈가 도입되지 않은 균주대비 약 1.5배 높은 수율을 보였다. 이렇게 얻어진 유리지방산은 황산과 메탄올과 반응하여 지방산 메틸 에스테르로 전환되었다. 그리하여 최종적으로 글루코스 대비 약 13%의 수율로 지방산 메틸 에스테르, 즉 디젤을 생산할 수 있었다.
이 연구는 대사공학적 접근을 바탕으로 하여 유리지방산의 생산성이 증가된 균주를 만들었고, 이 균주를 위해 배양 조건을 최적화 하였으며, 이 두 결과를 통해 행해진 발효에서 실제로 얻어진 유리지방산을 화학적인 방법을 통하여 디젤로 사용가능한 지방산 메틸 에스테르를 만들었다. 이것은 기존의 식량에서 유래되는 디젤의 원료와는 다르게 미생물 유래의 원료로부터 디젤을 만들었다는 데에 의의가 있다.
