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Metabolic engineering of escherichia coli for the production of L-isoleucine = 대장균의 대사공학을 통한 L-이소루신 생산
서명 / 저자 Metabolic engineering of escherichia coli for the production of L-isoleucine = 대장균의 대사공학을 통한 L-이소루신 생산 / Jae Eun Oh.
저자명 Oh, Jae Eun ; 오재은
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2010].
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초록정보

Amino acids producing strains have traditionally been developed by random mutation and selection process. These approaches are now in transition towards rational metabolic engineering, in which the entire metabolic and regulatory networks are purposefully engineered. Here, this thesis focuses on the rational metabolic engineering of Escherichia coli for L-isoleucine production. First, feedback inhibitions of aspartokinase I, III and threonine dehydratase by L-threonine, L-lysine and L-isoleucine, respectively, were removed, and the native promoter containing the transcriptional attenuator leader region of the thrABC operon was replaced with the tac promoter. The metA, lysA, tdh and iclR genes were deleted to make more precursors available for L-isoleucine formation. The native promoter of the ppc gene was replaced with the trc promoter in the chromosome to increase the pool of oxaloacetate, a starting precursor of L-isoleucine biosynthesis. This strain was further engineered to remove all the negative regulations and overexpress the ilvA, ilvIH, ilvCED genes constituting an L-isoleucine biosynthesis. Then, branched-chain amino acid exporter encoded by ygaZH was amplified by plasmid-based overexpression, and global regulator encoded by lrp gene was amplified by chromosomal replacement in order to further improve the strain’s performance. The final engineered E. coli strain was able to produce L-isoleucine with a yield of 0.14 g L-isoleucine per g glucose, and 9.46 g/L L-isoleucine by fed-batch culture. The approaches described in this study are a good example of constructing 100% genetically defined microorganisms by rational metabolic engineering for the production of L-isoleucine, and they can also be generally applicable to development of strains for the efficient production of other valuable bioproducts.

L-isoleucine 은 필수 아미노산으로서 식품산업, 동물사료, 화장품 및 의약품의 원료로서 사용되는 고부가가치의 아미노산이다. 현재 L-isoleucine 은 미생물 내 복잡한 대사회로로 인해 주로 추출법을 통해 산업적으로 생산된다. 따라서 미생물을 이용한 자연친화적 방법으로의 L-isoleucine 생산은 경제적 비용을 줄일 수 있는 대안이다. 이번 연구에서 우리는 2007년 시스템 대사기법을 이용한 L-threonine생산 TH20 균주를 이용하여 무작위 돌연변이가 아닌 대사공학적 기법을 적극 활용하였다. 그러나 먼저 TH20 균주의 유전자는 L-isoleucine을 생산하지 못하도록 염기 서열이 바뀌어 있기 때문에 원래의 유전자로 복귀시키는 실험이 수행되었다. 이와 더불어 대장균 내의 복잡한 대사조절 메커니즘을 해결하기 위해 기존의 특허와 논문을 참고하여 L-isoleucine의 첫 번째와 두 번째 단계에 해당하는 효소 (threonine dehydratase, AHAS III)의 피드백을 site-directed mutagenesis 시켜서 해결하였다. 이 때 전자의 경우, 게놈 및 벡터 기반으로 모두 해결하였으나, L-isoleucine 에 의한 직접적인 영향을 받는 염기서열이 알려져 있지 않은 AHAS III 의 경우에는 L-valine 의 논문을 참고하여 같은 위치에 있는 염기서열을 바꾸었다. 그 결과 대장균에서 전혀 나오지 않았던 L-isoleucine 의 양이 무려 0.32 g/L 로 증가하였다. 우리는 이를 L-isoleucine 생산 기본 균주라 명명하였다. 그 후, L-valine 의 엑스포터로서의 기능이 알려진 YgaZH 가 L-isoleucine 의 엑스포터 역할 역시 한다는 것을 L-isoleucine의 analog 인 DL-4-thiaisoleucine 이 첨가된 실험을 통해 최초로 밝혔다. 이를 바탕으로 이 유전자를 벡터 기반으로 증폭한 결과, 기존의 기본균주보다 245%의 생산이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 더욱 높은 생산성을 얻기 위해서 L-isoleucine 생합성 경로와 관련된 여러 가지 유전자, 특히 L-isoleucine의 생합성 경로를 모두 증폭시켜 대사 흐름을 증가시킬 필요가 있었다. 그러나 벡터 기반의 증폭은 세포 성장 및 벡터 자체의 불안정성으로 인해 산업 기반의 발효 공정에 이용하기에는 부작용이 발생할 수 있으므로 게놈 자체를 조작할 필요가 있다고 생각되었다. 이에 각 유전자 앞에 존재하는 프로모터를 강력한 trc 프로모터로 바꾸어 유전자 조작 기법을 통해 대사회로의 흐름을 증가시킨 결과, 앞서 엑스포터를 증폭한 균주보다 90%의 높은 생산성을 보였다. 뿐만 아니라 같은 방법을 통해 대장균 내의 Lrp라는 전사인자를 증폭시켰다. Lrp 는 L-isoleucine 생합성에 중요한 효소인 AHAS III 와 YgaZH 엑스포터의 발현을 증폭시킨다고 알려져 있다. 결과적으로 이 Lrp 유전자를 증폭시킴으로써 34% 의 L-isoleucine 생산 증가를 확인하였다. 이 연구에서는 균주 개량에만 그치지 않고, Fed-batch 발효 역시 수행하였다. 그러나 초반에 feeding 이 되지 않는 단점이 발생하여 L-threonine의 생산성을 증가시키는 데에 기여한 성장인자인 biotin을 도입하여 영양분을 공급하였고, 그 결과 초반에 8.72 g/L 의 L-isoleucine 을 생산하였다. 한편 1 mol의 glucose로부터 해당과정을 거친 2 mol의pyruvate 는 TCA cycle를 통한 에너지 생산뿐만 아니라 다양한 바이오매스 구성성분을 생성하기 위한 전구체로도 사용된다. 이는 곧 세포 내의 pyrvuate 부족을 의미한다. 따라서 적당량의pyruvate 를 feeding solution에 추가하여 BCAA의 전구체로써의 역할과 TCA cycle의 활성화를 시켜 발효하였다. 비록 적은 양이 증가하였지만 최종적으로 8.95 g/L의 L-isoleucine 을 얻을 수 있었다. 이는 균주 개량을 통해 논문으로 발표된L-isoleucine 생산 대장균 균주 중 세 번째로 높은 농도를 기록했으며, pyruvate feeding및 biotin 과 같은 발효 조건을 최적화함으로써 glucose 고갈 시점을 단축했다는 점과 overall productivity 를 증가시켰다는 점에서 의의가 있다. 따라서 이 연구는 100% 대사 공학 기법을 통해 대장균에서 우리가 원하는 고부가가치 산물을 생산하는 방법을 제공하였고, 산업적 수준으로 원하는 산물을 생산할 수 있는 가능성을 제공하였다는 데 그 가치가 있다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MCBE 10031
형태사항 iv, 68 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 오재은
지도교수의 영문표기 : Sang Yup Lee
지도교수의 한글표기 : 이상엽
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p. 60-64
주제 Escherichia coli
Metabolic engineering
L-isoleucine
production
대장균
대사공학
L-이소루신
생산
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